Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии

Оглавление

Коллектив авторов. Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ПРЕДИСЛОВИЕ

Глава 1. ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ И КОНФОКАЛЬНАЯ ЛАЗЕРНАЯ МИКРОСКОПИЯ – ПРИНЦИПЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ

1.1. Основные понятия

1.2. Устройство флуоресцентного микроскопа

1.3. Принципы конфокальной микроскопии

1.4. Мультифотонная микроскопия

1.5. Конфокальная микроскопия в применении к исследованию динамических процессов и межмолекулярных взаимодействий

1.5.1. Восстановление флуоресценции после фотоотбеливания (Fluorescence Recovery After Photobleachin – FRAP)

1.5.2. Потеря флуоресценции во время фотоотбеливания (Fluorescence Lossin Photobleaching – FLIP)

1.5.3. Локализация флуоресценции после фотоотбеливания (Fluorescence Localization After Photobleaching – FLAP)

1.5.4. Фёрстеровская (флуоресцентная) резонансная передача энергии (Fӧrster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer – FRET)

Литература

Глава 2. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ КРАСИТЕЛИ И ДРУГИЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

2.1. Ядерные флуоресцентные красители

2.1.1. Цианиновые красители

2.1.2. Фенантридины

2.1.3. Акридиновые красители

2.1.4. Производные индола и имидазола

2.2. Индикаторы ионов

2.3. Флуоресцентные нейротрейсеры

2.4. Флуоресцентные метки

2.5. Флуоресцентные белки – генетически кодируемая флуоресцентная метка

Литература

Глава 3. КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ И ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

3.1. Особенности начальных этапов пробоподготовки

3.1.1. Фиксация материала

3.1.2. Декальцинация

3.1.3. Обезвоживание и заливка в парафин

3.1.4. Изготовление срезов

3.2. Процесс окрашивания препаратов для конфокальной микроскопии

3.2.1. Приемы, используемые для повышения чувствительности реакций иммунофлуоресценции

3.2.2. Приемы, используемые для раздельного выявления нескольких антигенов

3.3. Учет эффекта автофлуоресценции

Литература

Глава 4. ВЫЯВЛЕНИЕ СИНАПТИЧЕСКИХ СТРУКТУР НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ И ИХ ПРОСТРАНСТВЕННАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНФОКАЛЬНОЙ МИКРОСКОПИИ

Литература

Глава 5. ТРЕХМЕРНАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР В ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ ЧЕЛОВЕКА

Литература

Глава 6. ИЗУЧЕНИЕ ВЫСТИЛКИ ЖЕЛУДОЧКОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ КОНФОКАЛЬНОЙ ЛАЗЕРНОЙ МИКРОСКОПИИ

Литература

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1. Флуоресцентные красители, наиболее часто применяемые для окраски ядер клеток

Приложение 2. Органические флуорохромы, используемые для маркировки антител и конъюгации со стрептавидином

Приложение 3. Флуоресцирующие белки и их спектральные характеристики (по: Olenych S. G. [et al.], 2007)

Приложение 4. Иммуноцитохимическая реакция на синаптофизин

Приложение 5. Двойная иммуноцитохимическая реакция на синаптофизин и глутаматдекарбоксилазу

Приложение 6. Иммуноцитохимическая реакция на GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок)

Приложение 7. Иммуноцитохимическая реакция на виментин

Приложение 8. Двойная иммуноцитохимическая реакция на виментин и GFAP

Приложение 9. Двойная иммуноцитохимическая реакция на альфа-тубулин и GFAP

Отрывок из книги

В последние годы благодаря достижениям квантовой физики, молекулярной биологии и иммуноцитохимии, классические морфологические дисциплины приобрели совершенный инструмент для молекулярного анализа клеточных и тканевых структур. Сейчас можно констатировать, что на основе всестороннего использования новых молекулярных подходов происходит выделение передового направления в морфологии – молекулярной морфологии. Молекулярная морфология, аккумулируя знания, накопленные классической гистологией, эмбриологией, и патологической анатомией, способна занять ключевое место в интеграции клеточной биологии, биохимии, физиологии, молекулярной генетики и протеомики при решении фундаментальных проблем и прикладных задач биомедицинских исследований. Молекулярная морфология, используя постоянно расширяющиеся возможности новых методов конфокальной микроскопии, а также оптической микроскопии сверхвысокого разрешения, в скором времени должна решить насущную задачу создания нового поколения методов трехмерного молекулярного анализа клеточных и тканевых структур, пригодных для использования не только в практике научного исследования, но и в диагностических целях. Ожидаемые новые методы должны быть просты, надежны в использовании, высокоселективны и высокочувствительны. Успешное решение поставленной задачи требует от исследователя глубоких знаний о современных методических приемах иммуноцитохимии, флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. Одной из важных задач, стоящих перед морфологом, занимающимся научными исследованиями, является участие в комплексных исследовательских программах, объединяющих специалистов разного профиля с целью решения конкретной научной проблемы. Квалифицированному специалисту-морфологу для успешного выполнения задач комплексных междисциплинарных исследований уже недостаточно владения только основами общей, частной морфологии и патологии, но требуется также и понимание главных биофизических принципов, лежащих в основе феноменов, используемых при создании приборов, предназначенных для флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. Без этого невозможно разобраться в сложных настройках современных приборов, от правильного использования которых зависит окончательный результат кропотливой подготовительной работы. Облегчить специалистам-морфологам и научным работникам смежных специальностей знакомство с новыми методами микроскопии и показать, как можно с их помощью решать различные задачи, связанные с изучением структур клеток и тканей, должна помочь настоящая книга.

Технической базой для реализации представленных в приложениях протоколов и иллюстраций, помещенных на вклейках, послужил комплекс оборудования и программного обеспечения, разработанный фирмой Zeiss (Германия), который включает конфокальные лазерные микроскопы LSM 710 и LSM 510 Meta. Иммуноцитохимические протоколы и общие принципы работы с конфокальным микроскопом универсальны и могут успешно использоваться с оборудованием любых производителей.

.....

где Iv и Ih – интенсивности флуоресценции вертикально и горизонтально поляризованного испускания в случае возбуждения образца вертикально поляризованным светом.

При планировании экспериментов с использованием флуорохромов, особенно флуорохромов нового поколения – квантовых точек – необходимо учитывать возможность мерцания флуоресценции. Это стохастический процесс перехода флуорохрома из флуоресцирующего состояния в состояние отсутствия флуоресценции, несмотря на постоянное возбуждение. В результате, при наблюдении за одиночными флуоресцирующими комплексами возникает стробоскопический эффект (зрительная иллюзия неподвижности или мнимого движения предмета при его прерывистом наблюдении). Кроме этого, поскольку время нахождения флуорохрома во «включенном» и «выключенном» состоянии является случайным, сравнение результатов независимых экспериментов при использовании таких флуорохромов затруднено. При конфокальной микроскопии данный эффект может быть компенсирован за счет линейного или покадрового усреднения сканируемых изображений.

.....