Читать книгу Основы клинической морфологии зубов: учебное пособие - Группа авторов - Страница 7

Ткани зуба являются в основном минерализованными образованиями, сходными с костной тканью, но имеющими морфологические особенности, требующие несколько иного подхода к подготовке их для микроскопического исследования.

Для изучения тонкого строения зубов используют обычно декальцинированные срезы, заключенные в целлоидин, или шлифы зубов.

Изготовление декальцинированных срезов включает следующие этапы: фиксацию, декальцинацию, обезвоживание, заливку в целлоидин и окраску срезов.

Фиксация. Выделенный фрагмент челюсти либо зубочелюстной сегмент у экспериментальных животных или от трупа (лучше в первые сутки после смерти) промывают проточной водой и затем обычно помещают сразу в 10 % раствор нейтрального формалина на 7—12 дней. В этом растворе материал может находиться и более продолжительное время.

Для фиксации тканей зуба показаны также крепкие спиртовые растворы: например, спирт-формалин, спирт-формалин-уксусная кислота, нейтральная смесь Шабадаша (спирта 96 % 100 мл, меди нитрата 1,8 г, кальция нитрата 0,9 г, формалина чистого 10 мл), жидкость Карнуа, смесь «Суза».

Следует помнить, что степень последующего воздействия декальцинирующих растворов на ткани зуба зависит от применяемого фиксатора. Лучше использовать спиртовые растворы формалина, а для гистохимических целей – фиксацию в жидкости Жандра (смесь из 8 мл, насыщенного раствора пикриновой кислоты на 90 % спирте 1,5 мл неразведенного формалина и 0,5 мл ледяной уксусной кислоты) или в фиксаторе Буэна – Дюбоска (смесь из 150 мл 80 % спирта, 1 г пикриновой кислоты, 60 мл неразведенного формалина, 15 мл ледяной уксусной кислоты). После фиксации исследуемый материал помещают на 20–24 Чв проточную воду.

Декальцинация. Процесс деминерализации тканей зуба может проводиться различными методами, однако следует помнить, что структуры эмали, которая содержит около 96 % минеральных солей, становятся после этого плохо различимыми. Наиболее подходящими для зубов декальцинирующими растворами являются органические кислоты (муравьиная, трихлоруксусная), а также некоторые минеральные кислоты (азотная, хлористоводородная и др.). Используют также жидкость Дженкинса следующего состава: крепкая соляная кислота—4 мл, ледяная уксусная кислота – 3 мл, хлороформ – 10 мл, дистиллированная вода – 10 мл, абсолютный спирт – 73 мл. Неплохими фиксирующими и одновременно декальцинирующими свойствами обладает смесь «Суза» по Гейденгайну: 4,5 г сулемы и 0,5 г поваренной соли растворяют при нагревании в 80 мл дистиллированной воды, затем добавляют 2 мл трихлоруксусной кислоты и 20 мл формалина.

Одним из самых распространенных способов декальцинации является помещение исследуемого материала на 8 – 12 дней в 5 % раствор азотной кислоты. Процесс декальцинации должен проходить при комнатной температуре. Раствор кислоты заменяют ежедневно, контролируя при этом степень деминерализации исследуемого кусочка челюсти с зубами или зуба. Контроль осуществляется ежедневной пробой на извлечение кальция 1 % оксалатом натрия. Простым способом контроля может служить вода: если вода легко проникает в ткани исследуемого кусочка, то он готов для проведения следующей операции.

Обезвоживание. После декальцинации исследуемый кусочек помещают в растворы спиртов возрастающей концентрации (40 %, 60 %, 80 %, 95 % и абсолютный 100 % спирт). В каждом из растворов кусочек должен находиться от 24 до 48 ч, а в абсолютном спирте – не менее 48–60 ч. Удаление воды необходимо для последующей качественной инфильтрации материала целлоидином.

Заливка в целлоидин. Из абсолютного спирта исследуемый материал помещают в смесь спирта с эфиром (50 % на 50 %), которую периодически меняют в течение 48–62 ч. Затем из этой смеси кусочек переносят в 2 % раствор целлоидина в хорошо закупориваемую посуду и оставляют в нём на 2–4 нед. После этого фрагмент челюсти с зубами или зубы последовательно помещают в растворы целлоидина возрастающей плотности: 4 %, 6 %, 10 % и 1 2 %, сохраняя в каждом растворе для достаточной пропитки не менее 2–3 нед (иногда до нескольких месяцев). Последний целлоидиновый раствор вместе с исследуемым материалом помещают в эксикатор, где целлоидин постепенно высыхает и уплотняется, причем его уровень снижается наполовину.

Блоки, заключенные в целлоидин, нельзя оставлять в сухом состоянии. Их следует поместить в 70 % спирт, а для длительного хранения – в смесь 70 % спирта и глицерина в банках с притертой пробкой.

Окраска срезов. Режут блоки хорошо заточенными ножами. Затем срезы толщиной в среднем 12–15 мкм помещают в чашку Петри с 70 % спиртом. Обычно целлоидин сразу «не покидает» срезы, поэтому их монтируют на предметном стекле только после окраски, обезвоживания и просветления. Срезы окрашивают серией красящих реактивов.

Срезы чаще всего окрашивают гематоксилином Делафильда и эозином по обычной методике. После окраски срезы помещают в карбол-ксилол (для полного извлечения целлоидина), затем в чистый ксилол и после этого – на предметное стекло с последующим заключением в бальзам.

Для окраски срезов декальцинированных зубов используют метод Шморля. Срезы окрашивают в течение 10–12 мин раствором тионина, затем споласкивают водой и переносят в концентрированный водный раствор пикриновой кислоты на 1,5–2 мин. Снова споласкивают в дистиллированной воде, затем дифференцируют в 70 % спирте до прекращения отделения из срезов красителя (обычно 5-10 мин), обезвоживают в 96 % спирте, карбол-ксилоле и монтируют на предметном стекле с заключением в бальзам. В результате окрашиваются одонтобласты с отростками и дентинные трубочки.

Основное вещество дентина, а также дентинобласты хорошо окрашиваются азаном, особенно после предварительной фиксации в смеси «Суза» с декальцинацией в азотной кислоте. Дентин можно окрашивать по Вейденрейху в анилиновой воде с генциановым фиолетовым после фиксации в жидкости Ценкера с формалином и декальцинацией зуба в 5 % растворе азотной кислоты.

Для изучения пульпы предварительно расколотый продольно зуб фиксируют в 10 % нейтральном формалине или жидкости Ценкера. Затем кусочек ткани извлекают из полости зуба и заливают в парафин или целлоидин. Окраска срезов проводится гематоксилином и эозином, азаном и другими красителями, применяемыми для окраски рыхлой неоформленной соединительной ткани.

Декальцинация в сильной степени влияет на структуру тканей зуба (например, эмаль разрушается почти полностью обычными методами деминерализации). Поэтому в определенных случаях зубы изучают на сделанных тонких распилах – шлифах.

Зубы, предназначенные для шлифовки, должны сохраняться в 1 0 % нейтральном формалине. С помощью крупнозернистого, а затем мелкозернистого шлифовальных кругов можно получить шлифы зуба необходимой толщины, а затем произвести зачистку поверхности наждачной бумагой. Обтачивать зуб значительно тяжелее, чем кость. Целесообразно сначала залить зуб в гипс и шлифовать с двух сторон. Обточенный до 0,5–1,0 мм зуб вынимают из гипса и продолжают обтачивать до необходимой толщины. Затем шлифсполаскивают в эфире, сушат и монтируют на предметном стекле как обычно.

Исследование эмалевых призм проводят на продольных и поперечных шлифах. Для изоляции эмалевых призм зуб помещают в 5-10 % раствор хлористоводородной кислоты до размягчения эмали. Затем эмаль расщепляют иглой в кювете с изотоническим раствором хлорида натрия. Полосы Гунтера-Шрегера выявляют путем помещения продольного шлифа на несколько секунд в 5 % раствор азотной кислоты с последующей основательной промывкой проточной водой.

Окраска дентина на шлифах зубов проводится по методу Кохана-Фуррера. Шлифы помещают в насыщенный водный раствор сулемы на 5–7 дней, затем переносят в свежеприготовленный сульфид аммония на 3–4 дня до интенсивной черной окраски, высушивают и заключают в бальзам.

Выявление органического матрикса проводят по Готтлибу путем окраски тонких шлифов насыщенным подогретым раствором сульфоализариновокислого натрия: шлифы помещают в раствор на несколько часов, а затем гладко полируют поверхность шлифа в 95 % спирте. После этого шлифы проводят через абсолютный спирт и ксилол с последующим заключением в бальзам.

Цемент зуба исследуют на шлифах или декальцинированных срезах по методикам, применяемым для окраски костей [14, 27].

Изучение различных стадий развития зуба у эмбрионов экспериментальных животных проводят после декальцинации фрагментов челюстей с зубами в трихлоруксусной кислоте (после фиксации в фиксаторах Буэна, Ценкера или смеси «Суза») с последующей заливкой в целлоидин и окраской.