Читать книгу Микробиология. Начало - Серафима Гурьева - Страница 3

Рост и размножение на плотных питательных средах:

Размножение – самовоспроизведение себе подобных.

Рост- формирование структурно- функциональных компонентов клетки и увеличение самой бактериальной клетки.

Фазы роста:

1) Фаза адаптации (2-3 часа).

2) Логарифмическая фаза роста (4-5 часов, для большинства бактерий)

3) Стационарная фаза (15-20 часов, бактерии не увеличиваются в количестве, они растут)

4) Фаза отмирания – дефицит питательных веществ, зависит от защитных свойств м.о.

Так же растя на питательных средах бактерии могут :

1) Светится (только сопрафиты)– процесс гниения.

2) Ароматообразование – образуют ароматические вещества (синегнойная палочка – запах земляники).

3) Пигментообразование – некоторые м.о. образуют красящие вещества.

4) Спорообразование – процесс образования спор в неблагоприятных условиях среды.

Культивирование бактерий:

Различают среды:

1) По конституции: жидкие, полужидкие, плотные. Плотные и полужидкие готовят из жидких, к которым добавляют агар-агар или желатин.

2) По составу: простые – мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, пептонный желатин, пептонная вода. ( Пептон – препарат, полученный из молока и мяса животных под действием протеолитических ферментов. На начальных стадиях процесса переваривания белков под действием ферментов, например, пепсина образуются крупные белковые фрагменты, которые и называются пептонами).

Сложные– готовят из простых добавляя к ним кровь, сыворотку, углеводы.

3) По источнику: естественные - готовят из продуктов животного происхождения, растительного.

Синтетического– готовят из определенных органических и неорганических соединений.

4) По назначению: Основные– МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода.

Специальные – для выделения и выращивания м.о. которые не растут на основных:

А) Элективный (избирательные) – для определения видов микробов, росту которых они стимулируют, задерживая или подавляя рост сопутствующей микрофлоры.

Б) Дифференциально -дианостческие –позволяют отличить один вид микробов от других по ферментативной активности ( Среды Гисса- углеводы и индикаторы).

Питательные среды- субстраты для культивирования( выращивания) м.о., необходимо для изучения свойств микробов: морфологических, биохимических, антипенных и т.д.

Требования к питательным средам:

1) Питательность – содержания достаточного количества питательных веществ в легкоусваемой форме.

2) Оптимальный водородный показатель – слабощелочная среда ( 7.2-7.4). Исключением является – возбудитель туберкулеза ( 6.2-6.8), холерный вибрион ( 8.5-9.0).

3) Буферность – способность нейтрализовать продукты обмена и поддерживать оптимальный уровень рH.

4) Изотоничность – осмотическое давление питательной среды равно соматическому давлению микробной клетки (0,5% р-р NaCl).

5) Стерильность – отсутствие посторонних м.о.

6) Окислительно- восстановительный потенциал– соотношение веществ способных отдавать и принимать электроны в процессе биохимических реакциях.

7) Унифицированность – наличие примерно одинакового набора компонентов, что обеспечивает возможность культивировать большое количество видов м.о.

8) Прозрачность – степень просматриваемости на свету, обеспечивает возможность изучения характера, объема роста м.о. на питательной среде через определенный промежуток времени.

Исходным сырьём для большинства сред- заводские полуфабрикаты, растворимые и животные продукты ( сыворотки, молоко, кровь, уголь и т.д.).

Этапы приготовления сред:

1) Варка на водяной бане, на открытом огне или в варочных котлах подогреваемых паром.

2) Установка оптимального рH с помощью индикаторных бумажек или специальными пробами (иномерами), корректировка рH среды при «+» растворов кислот и щелочей.

3) Осветление с помощью яичного белка для сред, которые при варке мутнеют или темнеют.

4) Фильтрация жидких и расплавленных сред через ватно-марлевый фильтр или путём отстаивания.

5) Розлив сред по пробиркам, флаконам, колбам и т.п.

6) Стерилизация зависит от состава среды и проводится в автоклавах, на водных банях или в свертывателе Коха (это металлический цилиндр, обшитый снаружи материалом (линолеум, асбест), плохо проводящим тепло. На дно наливают воду, а стерилизующий материал помещают сверху на подставку. Аппарат закрывают конической крышкой, в которой имеются отверстия для термометра и выхода пара. Внизу расположен кран для спуска воды. Стерилизацию проводят текучим паром при 100 °С в течение 30-60 мин. При таком режиме погибают вегетативные клетки спорообразующих и неспорообразующих форм микробов. В аппарате Коха стерилизуют те материалы, которые не выдерживают температуру выше 100 °С (желатин, молоко, углеводные среды и др.).

Белковые среды и сыворотку крови, не переносящие температуру 100 °С, стерилизуют дробно при 56-58 °С в водяной бане).

7) Контроль проводится с целью подтверждения стерильности и оптимальности рH.

Алгоритм приготовления простых питательных сред:

1) Мясопептонный бульон (МПБ):

А) К мясной воде «+» 1% пептон, 0.5 частей NaCl.

Б) Кипятят на слабом огне 10-15 минут до растворения веществ.

В) Оптимизируют рH, снова кипятят 30-40 минут, до выпадения осадка.

Г) Фильтруют, доливают до первоначально объема водой.

Д) Стерилизуют 20 минут при 120°С.

2) Мясопептонный агар (МПА):

А) К МПБ до или после стерилизации»+» 2-3% измельченного агар-агара.

Б) Кипятят, помешивая на слабом огне до полного расплавления агара. Можно варить в аппарате Коха или в автоклаве.

В) При необходимости готовую среду осветляют (яичный желток).

Г) Фильтруют, стерилизуют 20 минут при 120°С.

3) Желатиновый столбик – простая среда, в пробирке нужна для определения протеолитических свойств бактерий (расщепление белка). Разжижение желатина – протеолитическая активности.

4) Хромотогеные среды (ХС)– питательные среды, позволяющие по окраске колонии делать предварительные заключения о виде выделенного м.о.

Принцип действия ХС– реактивы в составе среды, взаимодействуют с ферментами м.о. специфичными только для этого вида с образованием окрашенных веществ.

Алгоритмы приготовления сложных питательных сред:

1) Среда с углеводами:

А) Сахарный бульон (СБ)– сложная жидкая питательная среда:

1) К МПБ нейтральной реакции «+» 0.25-2% глюкозы (растворяют в небольшом количестве дистиллированной воде).

2)Стерилизуют три дня подряд по 30 мин или однократно в автоклаве при 115°С 30 мин.

Б) Сахарный агар (СА) – сложная плотная питательная среда:

1) КМПА «+» 0.5-2% глюкозы (растворяют в небольшом количестве дистиллированной воде).

2) Стерилизуют три дня подряд по 30 мин или однократно в автоклаве при 115°С 15 мин.

2) Дифференциально –диагностические среды– предназначены ля определения ферментативной активности культур бактерий, это плотные питательные среды или полужидкие по консистенции, содержащие субстрат индикатор, позволяющий по изменению цвета судить о наличие у бактерий исследуемой культуры ферментов для расщепления субстрата.

А) Среда Эндо– среда для выделения энтеробактерий ( группа бактерий, которые вызывают инфекции ЖКТ и др органов):

1)100 мл МПА рH=7.4 расплавляют на водяной бане или в текучепаровом аппарате.

2) Охлаждают до 70°С и «+» 1 грамм лактозы (предварительно растворяют в воде).

3) В отдельной пробирке готовят 2-3 мл насыщенного раствора фуксина.