Читать книгу Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие - И. М. Спивак - Страница 5

Для того чтобы начать серьезный разговор о репарации, необходимо вспомнить основные детали репликации ДНК. Важно понимать, что все процессы ДНК-метаболизма тесно связаны между собой и белки, вовлеченные в репликацию и рекомбинацию ДНК, способны принимать участие в различных процессах репарации. Для наглядности рассмотрим схему процесса репликации у прокариот, представленную на рис. 1.

Рисунок 1. Схема репликации ДНК у E.coli. На панели а схематически показаны белки в Y– раскрученной вилке репликации ДНК, но в реальности вилка репликации свернута в трех измерениях и образует структуру, подобную той, что изображена на вставке б.

Сфокусируемся на схематическом изображении а. В репликативной вилке одновременно активны две молекулы ДНК-полимеразы. Одна движется постоянно, производя новую дочернюю молекулу ДНК на ведущей нити, тогда как другая производит длинную серию коротких фрагментов Оказаки на отстающей нити. Обе полимеразы «заякорены» на их матрице с помощью ассоциированных с ними белков в виде «скользящего зажима» (sliding clump) и «загрузчика зажима» (clump loader).

ДНК-геликаза, активированная энергией АТФ-гидролиза, быстро движется вдоль одной из матричных нитей (на рис. 1 – ведущая нить), раскрывая ДНК-спираль прямо перед репликативной вилкой. ДНК-геликаза предоставляет основания ДНК-спирали ДНК-полимеразе ведущей нити, чтобы та могла их копировать. Ферменты ДНК-топоизомеразы облегчают раскручивание спирали ДНК.

В дополнение к матрице, ДНК-полимераза нуждается в праймере, «затравке», существующей до начала собственно самого основного процесса синтеза ДНК, небольшой цепи ДНК или РНК с концом, к которому и присоединяется следующий нуклеотид. По этой причине ДНК-полимераза отстающей нити нуждается в действии фермента ДНК-праймазы перед тем, как она начнет синтез каждого нового фрагмента Оказаки. Праймаза производит очень короткую молекулу РНК (как РНК-праймер) в качестве 5’-конца каждого фрагмента Оказаки, к которому ДНК-полимераза и будет достраивать нуклеотиды. Наконец, однонитевые участки ДНК внутри вилки покрыты множеством копий SSB белка (связывающего однонитевую ДНК, single strand binding), занимая открытую область ДНК на нитях-матрицах с их подготовленными для копирования основаниями.

В представленной на вставке б схеме репликационной вилки показано, что ДНК-полимераза отстающей нити остается связанной с ДНК-полимеразой ведущей нити. Это позволяет ДНК-полимеразе отстающей нити оставаться внутри вилки после того, как завершен синтез очередного фрагмента Оказаки. В результате, одна и та же полимераза снова и снова участвует в синтезе большого числа фрагментов Оказаки, необходимых для образования новой цепи ДНК на отстающей нити.

В дополнение к перечисленной группе коровых (основных) белков, для репликации ДНК необходимы и другие белки, не представленные на рис. 1. Среди них можно описать группу белков – инициаторов репликации, необходимых для организации каждой новой репликативной вилки на ориджине репликации, белок РНКазу, удаляющий РНК-затравки фрагментов Оказаки, и ДНК-лигазу, сшивающая близлежащие фрагменты Оказаки друг с другом при формировании непрерывной нити ДНК.

RecQ-подобные геликазы вместе с топоизомеразой III также играют важную роль в репликации, а не только в других клеточных процессах, таких как гомологическая рекомбинация и контроль клеточного цикла.

Таким образом, мы видим, что процесс репликации очень сложен и может приводить к ошибкам в генетическом тексте, например, за счет подстановки неправильно спаренного или измененного основания. Одновременно процесс репликации является постоянным источником разрывов ДНК в клетке. Во-первых, всегда есть еще не соединившиеся фрагменты Оказаки. Во-вторых, при остановке движения репликативной вилки, чем бы она ни была вызвана, начинается процесс деградации ДНК и появляются ее свободные концы. В-третьих, топоизомераза I (ТорI) катализирует две основные реакции – разрезание и воссоединение однонитевой, нормально спаренной ДНК для релаксации ее суперскрученности при репликации или транскрипции. Множество эндогенных факторов действуют на эти две реакции разобщающее и приводят к образованию и накоплению ТорI-разрешающего комплекса, который является переходным к образованию двунитевых разрывов ДНК со всеми вытекающими последствиями. Таким образом, в течение процесса репликации структура ДНК может повреждаться и изменяться, а это уже само по себе является материалом для репарации.

1.2.1. Репарация за счет проверки ДНК-полимеразой

Частота ошибочных встроек нуклеотидов в ходе репликации у бактерий составляет приблизительно 10^-7-10^-11. При этом известно, что ДНК-полимераза, синтезируя новую цепь, делает ошибки примерно в 100 раз чаще. Подобное увеличение точности репликации связано с тем, что одновременно ДНК-полимераза способна производить проверку встраивания. Большинство прокариотических, а также и эукариотических, полимераз в дополнение к полимеризующей активности в направлении 5'→3' имеет экзонуклеазную активность в направлении 3'→5'. При встраивании «неправильного» нуклеотида ошибка обычно (хотя и не всегда) распознается самой полимеразой, вероятно, из-за того, что в этом месте в двойной спирали образуется пузырь или впячивание, наличие которых не позволят полимеразе добавить следующий нуклеотид к растущему З'-ОН-концу. Процесс репликации не пойдет дальше до тех пор, пока «неправильный» нуклеотид не будет удален, а нужный не встанет на его место. У ДНК-полимеразы III E.coli эндонуклеазной активностью обладает субъединица ε (эпсилон), которая кодируется геном mutD, при инактивации которого возникают клетки с мутаторным фенотипом. Именно эта субъединица повышает точность ДНК-полимеразы III на 2–3 порядка. При мутациях гена mutD возникает дефект в системе проверки правильности встраивания нуклеотидов в направлении 3'→5'. В результате многие из неправильно встроенных нуклеотидов остаются во вновь синтезированной нити ДНК и с той или иной вероятностью приводят к возникновению мутаций.

Корректирующая 3'-5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы сама по себе является достаточно сложным и энергоемким процессом. При расчистке участка ДНК с неправильно спаренным основанием поисходит следующая цепь событий. Связывание dNTP с комплексом «ДНК-полимераза-матрица-З'-конец синтезируемой нити» протекает, как минимум, через два конформационных изменения ДНК-полимеразы. При попадании неправильного dNTP в реакцию оба эти конформационные изменения замедляются, что способствует перемещению неправильного конца в активный центр 3'-5'-экзонуклеазы (субъединицы ε) для расчистки участка ДНК вокруг неспаренного основания и его последующего ресинтеза. Так как биохимические реакции обладают некоторой инерционностью, в ходе расчистки удаляются не только неправильные, но и расположенные по соседству правильные нуклеотиды. Таким образом корректирующая активность ДНК-полимеразы не может превышать оптимальный предел, ведь в противном случае «сверхкорректная» полимеризация потребовала бы огромных затрат энергии, одновременно приводя к резкому снижению скорости синтеза ДНК. Этот предел и ограничивает повышение точности репликации примерной величиной 10².

Здесь нужно остановиться еще на двух моментах. Во-первых, на разных нитях ДНК корректирующая активность полимеразы проявляется в разной степени. Частота ошибок в отстающей нити всегда в 10–20 раз выше, чем в ведушей. Например, в клетке человека за раунд репликации образуется 2х10⁶ фрагментов Оказаки. В начале синтеза каждого из них ДНК-полимераза α (ошибочность которой 10^-4) присоединяет 30–40 dNМР к РНК-праймеру. В процессе объединения фрагментов Оказаки большая часть этих dNМР выщепляется. Если предположить, что в каждом фрагменте Оказаки остается хотя бы один dNМР, присоединенный с помощью ДНК-полимеразы α, то, учитывая, что лишь 3 % ДНК млекопитающих транскрибируется, в транскрибируемой ДНК за раунд репликации образуется примерно 60 ошибок, подлежащих коррекции. Это является логическим объяснением того, что у эукариот ошибочность отстающей нити на порядок превышает таковую величину для лидирующей нити, где ДНК-полимераза α участвует только в инициации синтеза на ориджине репликации; один раз на весь репликон.

Во-вторых, PolIII способна корректировать преимущественно трансверсии из-за того, что пара пурин-пурин и пиримидин-пиримидин легче распознаются корректирующей активностью ДНК-полимераз, чем некомплементарные пары пурин-пиримидин. В то же время транзиции и сдвиги рамки считывания преимущественно исправляются уже после завершения репликации системой репарации неспаренных оснований (MMR, missmatch repair).

Вследствие этого транзиции происходят чаще, чем трансверcии, хотя теоретически должно быть наоборот – ведь каждый пурин может быть заменен на один пурин или на три пиримидина, а каждый пиримидин – на один пиримидин или два пурина.

Что же играет главную роль в распознавании корректирующей активностью ДНК-полимеразы неправильно подставленного нуклеотида? Каким образом отделить в эксперименте фактор энергетический (необходимость образования водородных связей между двумя спаривающимися нуклеотидами) и фактор геометрический (необходимость правильной стереометрической формы образовавшейся пары)? Это в 1997 году удалось сделать Кулу с соавторами. Они использовали в качестве аналога тимина неполярный дифтортолуол (F) и соответствующий ему dFTP, который в полимеразной реакции подобен dTTP, но только стерически, так как совершенно не способен образовывать водородные связи. Удивительно, но частота ошибочного включения дифтортолуола напротив аденина оказалась на три порядка выше, чем частота такого же неправильного (вместо тимина) включения цитозина. То есть ДНК-полимераза предпочитает встраивать неспособный к образованию водородных связей, но более близкий к тимину стерически, фтортолуол, а не цитозин, способный к образованию водородных связей, но не столь идентичный тимину стерически. Таким образом, хотя это и выглядит почти фантастически, ДНК-полимеразы способны включать в синтезируемую нить любую органическую молекулу (представленную, естественно, в форме дезокситрифосфата), лишь бы она соответствовала структурным требованиям активного центра самого фермента и В-формы ДНК.

1.2.2. Участие корректирующих автономных экзонуклеаз в репликации и репарации ДНК

Корректирующая экзонуклеазная активность не обязательно является частью процессивной ДНК-полимеразы. Достаточно часто в клетке для коррекции новосинтезированной ДНК привлекаются многочисленные автономные экзонуклеазы. Эти экзонуклеазы способны отщеплять неправильный нуклеотид, образуя (или не образуя) комплекс с ДНК-полимеразами.

При синтезе ведущей нити основную роль играют ДНК-полимераза III Е. coli, ошибочность которой составляет 10^-6, а у эукариот ДНК-полимеразы ε и δ (ошибочность 10^-5). Различные автономные экзонуклеазы способны повышать точность этих процессивных полимераз в 5-10 раз.

При синтезе отстающей нити у Е. соli в объединении фрагментов Оказаки участвует ДНК-полимераза I. Точность этой умеренно процессивной полимеразы резко увеличивается в присутствии автономных экзонуклеаз.

Большинство систем репарации ДНК нуждаются в синтезе ДНК при исправлении ошибок. У Е. соli в репарации ДНК существенное участие принимает ДНК-полимераза I, точность работы которой явно увеличивается в присутствии автономных экзонуклеаз. В клетке человека за сутки образуется в среднем 10⁵ спонтанных повреждений ДНК в результате ее дезаминирования, депуринизации, окисления и неправильного метилирования. Большинство этих повреждений репарируются при участии ДНК-полимеразы β (ошибочность 10^-3), В результате этого в транскрибируемой ДНК каждый раунд репликации появляются приблизительно 3 ошибки, подлежащие коррекции. При работе другой системы репарации непроцессивные безнуклеазные сверхошибочные (ошибочность 10^-2) ДНК-полимеразы ведут синтез ДНК в обход повреждений в ДНК-матрице. После завершения синтеза на поврежденной матрице они должны быть заменены, по-видимому, с помощью репликативного фактора С, на основную элонгирующую ДНК-полимеразу δ (ошибочность 10^-5). Но в силу той же инерционности биохимических реакций замена не происходит мгновенно, что требует исправления ошибок (совершенных непроцессивными полимеразами напротив неповрежденной матрицы), в том числе с участием автономных экзонуклеаз. В экстрактах клеток человека недавно показана экзонуклеазная коррекция ошибок, допущенных сверхошибочной ДНК-полимеразой η (эта). Наконец, автономные экзонуклеазы участвуют в коррекции гетеродуплексов.

Все виды экзонуклеазной коррекции должны закончиться за время данной репликации. По-видимому, коррекция ДНК-полимеразных ошибок – весьма эффективный процесс, поскольку анализ генома человека показал, что дивергенция последовательностей в транскрибируемой ДНК составляет примерно 0,1 % при исследовании ДНК от 24 человек различных этнических групп.