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2. Algunos métodos manuales para la estimación de medidas

2.1 Qué medir y cómo

Hemos expuesto en el capítulo precedente las bondades del cerebro humano en el reconocimiento de las más sutiles características de las imágenes y su «incapacidad» para apreciar las dimensiones de las cosas. Y sin embargo, tanto en biología como en otras ramas de la ciencia, la magnitud de las cosas es la cualidad más relevante para el investigador, porque por medio de la comparación de estas magnitudes es como puede percibir y cuantificar las diferencias o las semejanzas entre los elementos que está estudiando.

Así, por ejemplo, la relación entre la dosis y su efecto suele detectarse por la variación de la magnitud de un parámetro sensible al tratamiento, como el número de elementos o el tamaño de los mismos; o por ejemplo, la influencia de unas determinadas condiciones experimentales sobre los seres vivos; o la pauta de crecimiento y diferenciación de una estructura anatómica. En todos los casos la clave se encuentra en las diferencias de magnitud entre el grupo control y los distintos grupos experimentales, o entre una y otra población experimental. Pero, ¿qué queremos decir con diferencias de magnitud? ¿De qué magnitudes estamos hablando?

Las dos magnitudes más frecuentemente buscadas en biología son el número de elementos presentes y el tamaño de los mismos. Si bien el recuento de elementos no presenta muchas dificultades, la determinación del tamaño de un elemento puede ser una tarea ciertamente complicada. Dependiendo de la forma que adopte el objeto de nuestro interés, el tamaño puede venir determinado por la longitud, como en los ofidios, el área, como en la amplitud de los territorios de caza, el volumen, como en la capacidad de almacenamiento de glucógeno del hígado, el perímetro, y un largo etcétera de otros muchos parámetros de muy diversa utilidad.

En cada caso debemos enfrentarnos a la imagen con herramientas distintas para estimar cada una de las magnitudes que apuntábamos. Podemos obtener una longitud con cierta exactitud utilizando una regla, pero el cálculo del área es una tarea un poco más compleja. Y no digamos si queremos obtener un volumen de algo tan pequeño como una célula; la tarea se nos puede antojar casi imposible.

Los primeros métodos de medida que vamos a describir podíamos denominarlos métodos manuales, porque para abordarlos no nos apoyaremos más que en la imagen y en algunos principios de la geometría. Con ellos pretendemos dotar de una herramienta lógica y sencilla al lector, rescatándolo momentáneamente de la tiranía informática.

Por otra parte, el estudio de estos métodos tiene el interés adicional de que constituyen el nexo natural con la estereología y que su estudio nos permitirá reflexionar sobre problemas geométricos y espaciales que, en ocasiones, parecen estar abandonados en las técnicas ordinarias de análisis de imagen asistido por computadora. Decimos que este conjunto de métodos de medida se encuentra muy próximo a la estereología porque se implementaron lejos de la tecnología digital del análisis de imagen, con una gran base geométrica, un claro objetivo cuantitativo y, justamente, para poder inferir información tridimensional a partir de cortes histológicos. Por estos motivos algunos colegas los consideran los auténticos métodos biológicos de medida. Nosotros no queremos ser tan taxativos porque somos conscientes de que los métodos computerizados aportan tantas y tan buenas soluciones, que sería un tanto irreflexivo negar sus ventajas. De todas maneras, los métodos que estudiaremos a continuación pueden sacarnos de algún que otro apuro cuando, por ejemplo, nuestro ordenador se niegue a seguir nuestras instrucciones.

2.2 Estimación del área

2.2.1 Aproximaciones geométricas

El cálculo del área de un objeto puede ser algo muy sencillo cuando el objeto se aproxima a una figura geométrica regular. La geometría nos facilita el cálculo de superficies de objetos regulares, circulares o rectangulares por ejemplo, a partir de su radio o de la longitud de sus lados. Pero este no suele ser el caso más frecuente y la aproximación a una figura de geometría regular no está exenta de cierta imprecisión, dependiendo de la forma del objeto y la capacidad de apreciación del observador.

Con un sencillo ejemplo podemos ilustrar cuándo sería aplicable el método basado en la aproximación a una figura geométrica regular. Supongamos que queremos averiguar el volumen de sangre que circula por un segmento de la arteria aorta de un centímetro de longitud; para ello disponemos de dos cortes transver-sales de sendas aortas fijadas en contracción y relajación (en sístole y diástole cardiaca), porque la presión sanguínea hace que se deforme la pared elástica de la arteria y es evidente que los momentos cumbres de máximo y mínimo contenido corresponderán a los volúmenes arteriales en ambas circunstancias¹. La imagen real se parece mucho al esquema presentado en la fig. 2.1.

Fig. 2.1 Idealización de la sección transversal de una arteria en estado de máxima dilatación (izquierda) y en relajación (derecha).

Nótese que la sección de la arteria se puede aproximar, en ambos casos, a un círculo, aunque más perfecto en la etapa de sístole que en la de diástole; la irregularidad apreciable en la diástole se debe a que, en este periodo, se produce un contorno festoneado en la arteria como consecuencia de la relajación de las fibras elásticas que forman la pared. Aun así podemos considerar que la luz de la arteria en ambos momentos se puede aproximar a un círculo, por lo que podremos estimar directamente en el microscopio, mediante un micrómetro ocular, o sobre imágenes fotográficas de las preparaciones, utilizando una sencilla regla, el diámetro interior de las aortas y aplicar la fórmula del área del círculo (A=πr²). Pero esta forma de medir el diámetro esta sujeta a una buena dosis de subjetividad, ya que es el observador quien decide cuál es el diámetro de la aorta, que puede ser o no el diámetro real.

Para evitar en cierta medida esta subjetividad, se ha venido utilizado otro método que consiste en inscribir el objeto en un círculo de área conocida, mediante la superposición de una plantilla de círculos concéntricos al objeto. Es algo semejante a como se mide el diámetro del dedo en algunas joyerías que utilizan un conjunto de anillos de diferentes tamaños. La medida así obtenida se ha denominado, tradicionalmente, área del círculo equivalente y también se encuentra repleta de una buena dosis de subjetividad. El área del círculo equivalente ha tenido un uso muy generalizado en el pasado y dio lugar a pequeños instrumentos que facilitaban su estimación. Un fabricante de microscopios diseñó un pequeño diafragma para el ocular que permitía cerrar un anillo alrededor del objeto situado en el campo de observación; un lector en forma de regla, dispuesto en el exterior del ocular, proporcionaba al investigador la longitud del diámetro del diafragma en un momento dado y le permitía estimar el área del círculo equivalente.

También podríamos inscribir el objeto en un paralelepípedo en lugar de en un círculo. De esa manera mediríamos dos diámetros, los dos lados del rectángulo, con lo que podríamos utilizar el valor promedio para calcular el área del círculo promedio. Esta otra forma de proceder no supone ningún incremento de fiabilidad, pero sí que nos facilitaría la obtención de la medida de los diámetros porque es mucho más sencillo trazar un rectángulo que inscriba al objeto que ajustar una circunferencia a lo largo de todo su perímetro.

2.2.2 Recuento de áreas unitarias

Podríamos limitar un poco más la subjetividad del observador complicando el sistema de medida mediante el trazado de un cuadrado que inscriba al objeto. En ese caso podríamos inscribir el objeto en esta figura geométrica, pero dividiendo, a su vez, el cuadrado en tantos otros pequeños cuadrados como fuésemos capaces de dibujar; Ahora deberíamos contar cuántos cuadraditos pequeños enteros caben dentro del perímetro del objeto; como sabremos el área de uno de ellos, la suma de todas las áreas será, aproximadamente, el área del objeto. Es obvio que este tipo de «papel milimetrado» nos permitiría aproximarnos al área total del objeto de manera más objetiva, teniendo como límite de apreciación el tamaño del cuadradillo más pequeño. Es un método más fiable pero muy laborioso. Ya veremos más adelante como la automatización ha solventado el problema del trabajo manual.

2.2.3 Método de la pesada

Pero en muchas ocasiones necesitamos la medida del área como parámetro comparativo entre dos lotes experimentales. En este caso la comparación de las áreas puede realizarse por medio de otros estimadores más sencillos y menos laboriosos. Pondremos como ejemplo un caso que contribuyó decisivamente al desarrollo de las técnicas automatizadas de medida.

En los inicios de la era industrial, las factorías del acero necesitaban disponer de una norma con la que clasificar la calidad de los aceros que estaban produciendo. Tal calidad dependía de la cantidad relativa de hierro y carbón en la aleación, con lo que los laboratorios de control de calidad se propusieron desarrollar un método con el que estimar la proporción de ambos componentes de la aleación, analizando el área relativa de ambos en una imagen microscópica. Un conjunto de técnicos preparaba las láminas de acero que eran fotografiadas al microscopio; las imágenes presentaban dos tipos de manchas de distinta tonalidad que correspondían al hierro y al carbón. A continuación se recortaban las manchas en las fotografías para hacer dos montones de retales, uno para cada tipo de componente. Como el grosor del papel fotográfico era el mismo en toda la foto y la cantidad de plata que daba el tono más o menos oscuro a cada mancha de los componentes era tan reducida como despreciable, la abundancia de cada componente era proporcional al peso de los retales de cada especie. Esta medida relativa se expresaba como una fracción, peso de uno partido por peso del otro, o como el valor porcentual de un peso y del otro respecto al peso total.

El fundamento teórico del método de la pesada lo podemos encontrar fácilmente si aplicamos el concepto de densidad.

La densidad de una sustancia se define como la relación entre una determinada masa y el volumen que esta ocupa. La relación se mantiene constante sea cual sea la cantidad de sustancia considerada, por lo que si tomamos dos fragmentos cualesquiera del papel fotográfico (con masas m₁ y m2 respectivamente), y suponiendo que la escasa cantidad de emulsión fotográfica no modifica sustancialmente la densidad, podremos expresar esa relación, para cada fragmento, de la siguiente manera:

si calculamos los respectivos volúmenes (v₁ y v₂) en función de la respectivas superficies tendremos que

Sí eliminamos el término «grosor», la expresión queda justo como habíamos expuesto más arriba:

El método es tan ingenioso como laborioso porque, para darle validez estadística a los datos, se debía preparar un buen número de fotografías que habían de ser recortadas y pesadas. En estas circunstancias el trabajo final llegaba a ser importante, sin contar con el tedio que suponía la rutina general. Pero no podemos hacer otra crítica y tenemos que reconocer que se trata de un estimador del área muy aceptable.

2.2.4 Estimación del área por el método de la rejilla de puntos

La idea que subyace en el método de la pesada es que la fase más abundante en una foto ocupará mayor cantidad de área, por lo que la suma de los pesos de los trozos de papel que constituyen dicha fase será mayor que los pesos del resto de las fases. Lo mismo lo podemos enunciar en términos matemáticos diciendo que: «la probabilidad de que encontremos un trozo de hierro o carbón dependerá de su abundancia». O sea, que si dejamos caer al azar una minúscula gota de tinta sobre la fotografía de un acero, la probabilidad de que caiga sobre uno u otro componente dependerá únicamente de la abundancia de dicho componente. Pues bien, siguiendo ese principio, la determinación del área que ocupa una fase se puede ver desde un punto de vista probabilístico.

Si superponemos sobre la imagen una rejilla formada por puntos distribuidos regularmente, la cantidad de área que ocupa una determinada fase será proporcional al número de puntos (n) que caen sobre dicha fase. Si conocemos el total de puntos de la rejilla (N) y el área en la que se encuentran distribuidos (Área de referencia), el área de la fase se puede obtener por medio de una simple regla de tres. Es decir:

Fig. 2.2 Rejilla de puntos sobre una imagen.

El cociente n/N se conoce como fracción de área y es justamente la relación entre los puntos que caen sobre la fase de interés y los puntos totales que contiene el área de referencia. De ahora en adelante nos referiremos a la fracción de área, de forma abreviada, como A_A y su significado será el de: la proporción de área ocupada por la fase, o por un elemento, respecto al área de referencia; su valor se suele expresar en tantos por ciento.

El método es igualmente válido si se aplica una plantilla en la que el mismo número de puntos se encuentra repartido sin orden, en una distribución al azar. Se trata de una forma manual y simplificada del primitivo procedimiento denominado flaying spot (véase capítulo 3), en la que se ha predeterminado la situación de los puntos sobre la plantilla. Su aplicación se basa estrictamente en la aplicación del principio de probabilidad geométrica (véase capítulo 13).

La limitación principal para la utilización de plantillas con distribución regular o irregular de puntos está en que los objetos que pertenecen a la fase de interés se encuentren ordenados o no en la imagen. Esta afirmación casi resulta obvia si tenemos en cuenta que en una distribución regular de elementos pertenecientes a una misma fase, la ordenación de los puntos de la rejilla puede no coincidir nunca con los elementos de la fase o, por el contrario, que el número de coincidencias de puntos y estructuras de la fase sea excesivamente elevada. En ese caso se rompe la situación viciada utilizando una plantilla cuyos puntos se encuentren distribuidos aleatoriamente.

2.3 Estimación de la longitud

Uno de los parámetros que revistió más dificultad de cálculo, hasta que comenzó la aplicación del ordenador digital al análisis de imagen, fue la deter-minación de la longitud de un objeto. Se puede pensar que los objetos rectilíneos se miden fácilmente con una regla y que se puede calcular su longitud a escala real, multiplicando la medida obtenida por un factor de corrección. Pero, lamentablemente, las más de las veces los objetos suelen ser irregulares, con curvaturas, salientes y entrantes. En objetos muy estrechos solemos hablar de longitud, pero en la mayor parte de los casos hablamos de longitud y anchura. Incluso podemos hablar de determinar el perímetro, el cual se puede determinar como la longitud del borde que limita el objeto.

Para los objetos rectilíneos y estrechos, se pueden obtener buenos resultados utilizando una regla. También disponemos de un pequeño instrumento, el planí-metro, que nos permite obtener longitudes curvas y, por lo tanto, perímetros. Pero este instrumento ha ido cayendo en desuso y cada vez es más difícil encontrarlo en los laboratorios. Aunque los modernos sistemas de análisis de imagen han resuelto con sencillez el problema de la obtención de los principales diámetros de un objeto, la morfometría cuenta hace tiempo con un método que, como veremos, permite determinar longitudes de manera simple y efectiva.

2.3.1 El método de Buffon

Sea como fuere, el cálculo de la longitud de un objeto no parece, a primera vista, una cosa sencilla. Y no lo sería si no fuera porque Buffon² se hizo esa misma pregunta hace años y llego a proponer una solución tan simple como la que describimos más abajo.

Buffon planteó el problema de la medida de la longitud de unas agujas de igual tamaño. Postuló que, si se dejan caer las agujas al azar sobre una hoja en la que ha dibujado un conjunto de líneas paralelas equidistantes una distancia d, la probabilidad (p) de que una aguja de longitud L toque una línea paralela es:

Fig. 2.3 Las agujas de Buffon.

Esto quiere decir que la probabilidad depende, de manera directa, del tamaño de las agujas y, de manera inversa, de la distancia entre las líneas paralelas. Ambas cosas resultan obvias porque es más fácil que se produzcan coincidencias cuando las líneas paralelas están separadas una distancia menor que la longitud de las agujas, que cuando las agujas sean muy pequeñas y la distancia entre las paralelas sea muy grande. Esto mismo lo hemos querido representar gráficamente en la fig. 2.4.

Se puede llegar a la fórmula (2.6) de una manera muy simple. Una aguja cualquiera, perpendicular a las líneas paralelas tiene una probabilidad (p) de intersección con cualquiera de ellas:

Fig. 2.4 Cálculo de intersecciones entre las paralelas de Buffón y dos conjuntos de líneas de longitud L y L/2 respectivamente. Es obvio que la probabilidad de intersección en el primer caso, el grupo de líneas de longitud L, será el doble que en el conjunto de longitud L/2.

Cuando la aguja no es perpendicular a las líneas de test, la probabilidad de intersección depende del ángulo (α) que formen entre sí. De hecho, la probabilidad de intersección en cualquier posición del segmento L se puede expresar en función de su proyección (y) sobre un eje perpendicular a las líneas de test (fig. 2.5):

Fig. 2.5 Proyección de una aguja sobre el eje de ordenadas.

en donde la longitud de la proyección y se puede calcular como

La probabilidad de intersección será entonces

Para considerar todas las posibles orientaciones del segmento respecto a las líneas de test, debemos integrar la función (2.9) entre cero y 90 grados (π/2 radianes), lo que nos permite expresar la ecuación como:

que es exactamente la ecuación (2.5).

Podemos utilizar a expresión (2.5) para despejar L. Así,

lo que quiere decir justo lo que acabamos de expresar más arriba, pero de forma matemática: la longitud de una aguja se puede calcular si conocemos un sistema de referencia de líneas paralelas y la probabilidad de que las líneas corten a las agujas cuando las dejamos caer al azar.

La probabilidad a la que nos estamos refiriendo una y otra vez tiene el sentido tradicional que todos conocemos; es decir, se trata de un estimador de cuántas veces se produce un evento concreto cuando se repite el ensayo un número determinado de veces. Tal vez el ejemplo paradigmático sea el de la moneda que se tira al aire: el evento favorable «sacar cara» tiene una probabilidad de que ocurra p=1/2, porque el total de eventos posibles, «cara» y «cruz», son solamente dos. La forma práctica de calcular experimentalmente esta probabilidad consiste en lanzar la moneda al aire una serie de veces (N) y anotar cuantas de estas veces sale cara (Vcaras), entonces la probabilidad es p =Vcaras/N y, si lo hemos hecho de manera correcta, el valor de esta probabilidad coincidirá con la expuesta arriba p=1/2.

Para el caso que nos ocupa, la probabilidad de que se produzcan cruces entre líneas paralelas y agujas se podría calcular tal y como lo hicimos con la moneda: si realizamos el experimento N veces y el número de intersecciones agujas-conlíneas-paralelas es n, la probabilidad, p, se puede expresar como

Si sustituimos esta expresión en la (2.11) podemos proponer una nueva ecuación:

que nos permite estimar la longitud de las agujas de manera experimental, contando el número de intersecciones entre agujas y líneas paralelas.

Si realizados la medida una sola vez, N=1, la expresión se simplifica y queda:

en donde el término (nd) es el número de intersecciones por línea (I_L= nd).

Pero la aplicación de este procedimiento puede ir más allá del simple cálculo de las longitudes. Se puede aplicar para calcular el perímetro de una figura plana.

2.3.2 Cálculo del perímetro

Fig. 2.6 Cálculo del perímetro de un elemento.

Si consideramos que el perímetro está formado por un conjunto de segmentos iguales, como hemos dicho antes, aplicando el mismo principio se puede escribir la expresión como

en donde I_L es también el número de intersecciones de la línea que forma el perímetro con las paralelas separadas una distancia d.

Podemos demostrar la validez del método con un ejemplo: supongamos que se quisiera calcular el perímetro de una circunferencia de radio r. Si trazamos una serie de líneas paralelas separadas una distancia d=r, el número de intersecciones entre las líneas paralelas y la circunferencia será n=4 (fig. 2.7). ¿Por qué n=4? Porque la circunferencia sólo puede caer de dos maneras entre las paralelas:

Fig. 2.7 Cálculo de la longitud de una circunferencia.

1 Si hacemos que una de las líneas paralelas sea tangente a la circunferencia, la siguiente línea cortará a la circunferencia por el mismo centro, y la siguiente paralela también será tangente a la circunferencia. Por lo tanto el número de puntos que intersecta será n=4: dos en las tangentes, más dos en la línea secante que pasa por el centro (fig. 2.7 A).

2 Si hacemos que la primera línea paralela sea secante a la circunferencia, la siguiente será secante también y el número de puntos también será n=4 (fig. 2.7 B y C).

Sustituyendo en la fórmula (2.14) obtendremos la siguiente expresión:

que simplificando queda

lo que resulta la bien conocida expresión de la longitud de una circunferencia.

El método es más exacto cuando se aplica en el cálculo de perímetros curvos que cuando se utiliza para calcular el perímetro de formas angulosas. La imagen siguiente (fig. 2.8) muestra la aplicación del método al cálculo del perímetro de un cuadrado y se puede comprobar el error que se introduce en estos polígonos. Conforme se incrementa el número de lados, tanto más se aproxima la figura a la circunferencia y más exacta es la determinación.

Fig. 2.8 Cálculo del perímetro de un cuadrado de lado 2d por el método de Buffón.

El criterio correcto de aplicación del método de Buffon es el mismo que rige en la obtención de cualquier magnitud: se debe calcular el perímetro varias veces, superponiendo cada una de ellas el sistema de paralelas al objeto haciendo que la superposición sea de forma aleatoria. La expresión de la medida será el promedio de cada una de las determinaciones y el error relativo será la desviación tipo.

En el ejemplo se muestran tres cuadrados iguales de lado 2d dispuestos sobre una serie de líneas paralelas separadas una distancia igual a d. Aplicando la fórmula del perímetro del cuadrado a este caso tenemos:

Si ahora aplicamos el principio de Buffon al cálculo del perímetro de cada uno de los cuadrados tendremos:

Es evidente que ninguno de los perímetros calculados coincide con el perímetro esperado porque, para que así fuese, el número de intersecciones de los cuadrados con las paralelas debiera ser aproximadamente de 5,095 y esto es, claramente, el promedio de intersecciones que se pueden obtener después de realizar la prueba un buen número de veces.

La conclusión es, como ya sabíamos, que se trata de un método basado en la probabilidad geométrica y que su exactitud también se encuentra sometida a las leyes de la estadística.

2.4 Errores de medida

2.4.1 Unidades de medida y errores

La preocupación por la exactitud de la medidas no es un asunto exclusivo de la morfometría sino que se trata de un problema de carácter general. El hombre desarrolló, cuando tuvo necesidad de ello, un sistema de pesas y medidas con el que resumir el mundo al número. Este hecho le permitió calificar los fenómenos y las cosas con una propiedad inherente a ellos mismos: sus dimensiones. El número revolucionó el pensamiento helénico y luego, gracias a los árabes, revolucionó el mundo renacentista. Aquella revolución ha llegado hasta nuestro tiempo, con las acotaciones pertinentes producto de cientos de años de experiencia en la obtención de las medidas de las cosas.

Cada comunidad había desarrollado un patrón de medida (tomemos la longitud como ejemplo), que había subdividido o ampliado para tratar de obtener las dimensiones de las cosas pequeñas y las grandes. En todos los casos, y para desespero de los científicos de la época, el objeto medido no solía contener un número exacto de veces el patrón de referencia. Esto ocurría siempre, aunque se subdividiese la unidad de medida una y otra vez. Además, cada individuo apreciaba de manera distinta cuántas veces se contenía la unidad de medida en el objeto al realizar la medida. Incluso cuando un mismo experimentador medía varias veces el mismo objeto, obtenía distintos valores en cada medida.

La física, que es la encargada de estos temas dimensionales, introdujo el concepto de error para explicar la limitación del patrón de medida y del experimentador. Así, la primera limitación, la falta de coincidencia de la unidad de medida con el objeto un número entero de veces, se podía salvar indicando el número de veces que se contenía la unidad de medida, más el número de fracciones de la unidad que aún era mayor el objeto (eso supone la invención de los números reales), pero añadiendo una coletilla donde se indicaba cuál era la fracción más pequeña en la que se había subdividido la unidad que se estaba utilizando. Esto se interpretaba como que la fracción de la unidad de medida no daba más de sí y que el objeto media, por lo tanto, más o menos esa cantidad fraccionaria. A ese último término le llamamos error absoluto y nos permite saber cuan fiable es el instrumento de medida del que nos servimos.

Para glosar con un ejemplo lo que acabamos de decir, queremos recurrir a una situación doméstica corriente: imagínense que van a comprar doce metros de cable eléctrico a la ferretería para construir un alargador para enchufar su nuevo ordenador a la red eléctrica. Todos esperamos que el dependiente nos corte un trozo de cable equivalente a doce veces una vara o una cinta de un metro de longitud. Pero imagínense que en la ferretería tienen una vara que mide cinco metros y que no esta subdividida de ninguna manera. Está claro que medirá con toda precisión cables que contenga la unidad de medida un número entero de veces, es decir, cinco, diez, quince metros. Incluso podrá medir, aunque con menos exactitud, siete metros y medio o doce metros y medio, lo que equivale a tomar la mitad de la vara, 2,5 metros, (aquí tendremos que fiarnos del buen ojo del dependiente). Todo lo que sea menor de esa medida tomada con esa unidad será un intento de aproximación a la longitud de cable, tanto más dudoso cuanto más se aleje de la fracción 2,5 metros.

Afortunadamente, en lo cotidiano no llegamos a encontrarnos dependientes con tan mala unidad de medida, sino que las tiendas cuentan con unidades de un metro, divididas en cien fracciones (centímetros). Seguramente podremos adquirir doce metros de cable, centímetro arriba, centímetro abajo. Esto se puede expresar como 12,00 ± 0,01 metros, lo que se lee como «doce metros, más o menos un centímetro».

No obstante, el error que se comete midiendo el cable con una barra de un metro de longitud (tomando doce unidades para completar los doce metros) es mayor que el error que se comete si utilizamos una cinta de doce metros y se realiza la medida de una sola vez, porque los errores de medida son aditivos.

Si compramos dos trozos de cable en dos tiendas distintas, pidiendo en cada caso la misma longitud de cable, y los comparamos cuidadosamente, comprobaremos que uno es más largo que el otro. ¡Aunque cada dependiente se haya tomado el mismo interés en realizar la medida! El experimentador sabe que, por muy bueno que sea el instrumento, la medida del objeto no la obtiene nunca de forma exacta, sino que se aproxima a ella tanto más cuanto más veces se realice la misma.

Ambos errores son insolubles y hoy han entrado a formar parte de lo que llamamos condiciones de la medida.

Una cuestión casi obvia es la relatividad del error; esto es, la relación entre el error absoluto y la medida a obtener. Es una forma de indicar lo ajustado de la medida: siempre será más precisa la medida del cable de doce metros determinada con un error de un centímetro, que la medida de un cable de medio metro con el mismo error. Denominamos error relativo al cociente entre el error absoluto y la magnitud medida.

2.4.2 Precisión del método en función del número de puntos de la rejilla

El error relativo de una medida depende del error absoluto, digamos del error intrínseco del instrumento de medida, y de la magnitud obtenida. Su cálculo es muy simple cuando utilizamos una regla, dividida en milímetros, con la que medimos la longitud del cable alargador; el error absoluto será igual a 0,01 metros, mientras que el error relativo se obtendrá del cociente

Pero, ¿cómo obtenemos el error en el caso de la medida del área a partir del método de la rejilla de puntos? Es fácil pensar que la exactitud de este método del cálculo es más que discutible, dependiendo del tipo de rejilla que utilicemos.

En efecto, si se utiliza una rejilla con tan solo cuatro puntos, por ejemplo, y el objeto toca un único punto, el área del objeto sería igual a 1/4, independientemente del tamaño del objeto. Si, por el contrario, el objeto no toca ningún punto, el área será cero. Igualmente podemos ponernos en el otro extremo y pensar que para tomar una medida válida se necesitaría superponer una rejilla con tal cantidad de puntos que haría inviable la utilización del método.

Pero, como ya se puede suponer, siempre se puede llegar a una situación de compromiso en la que, estableciendo a priori un error tolerable, podamos superponer una rejilla con suficientes puntos como para que se pueda hacer viable el recuento.

Fig. 2.9 Representación gráfica del efecto del número de puntos de la rejilla sobre la estimación de la fracción de área.

La estadística nos dice que la estimación de la fracción de área por medio del recuento de puntos presenta una distribución de tipo binomial, en la cual el error estándar de una proporción cualquiera ρ viene dada por la expresión:

A partir de esta expresión, Hally³ propuso una fórmula con la que calcular el error relativo estándar de la medida de la fracción de volumen, y que nosotros hemos adecuado a este problema:

en la que AA es la fracción de área correspondiente n/N;

n es el número de puntos que contiene el objeto y

N es el número de puntos totales de la rejilla.

Por lo tanto, haciendo una estima previa de la fracción de área con una rejilla cualquiera, podemos estimar cuál es el número idóneo de puntos totales de la rejilla para asumir un error máximo determinado.

Despejando n

Y como

El número de puntos totales que debe tener la rejilla para obtener una fracción de área con un error relativo determinado, será:

Un ejemplo ayudará a aclarar la utilidad de este apartado. Para ello vamos a utilizar la fig. 2.9.

De los 72 puntos (N = 72) que forman la rejilla, hay un total de 16 (n = 16) que caen en el interior del objeto A, por lo que su fracción de área A_A = 16/72 = 0,22.

Aplicando la fórmula de Hally obtendremos un error relativo de

Lo que supone un error del 22,07 %, partiendo de una rejilla de 72 puntos.

Para calcular el tamaño de rejilla necesario para obtener la fracción de área con un error menor o igual al 10 % tendríamos:

Esto es, deberíamos preparar una rejilla que contuviese más de 355 puntos, lo cual supondría que unos 78 puntos habrían caído dentro del objeto A.

Bien mirado no se trata de una rejilla excesivamente densa, aunque obtener la medida con precisiones mayores puede llegar a hacer imposible la preparación de una rejilla adecuada, y no digamos cómo de compleja podría ser la tarea de recuento de puntos.

2.4.3 El error experimental

El concepto de error en las ciencias experimentales tiene otras perspectivas, relacionadas con la heterogeneidad del universo de medida. El principal estimador de cualquier parámetro experimental es el valor promedio de las medidas realizadas, el cual se encuentra directamente relacionado con la variabilidad de la muestra. Para estimar la dispersión del promedio se calcula la desviación tipo, que se puede entender como el promedio de diferencias entre los valores obtenidos y la media.

Comúnmente se denomina error tipo a la diferencia promedio, porque el investigador utiliza este valor, entre otras cosas, para comprobar el grado de reproducibilidad de sus experimentos y, por lo tanto, comprobar si se han producido errores en la manipulación o el diseño de los experimentos.

No vamos a profundizar aquí sobre el análisis estadístico de los resultados porque creemos que el lector dispone de otras fuentes, más adecuadas que esta, para procesar adecuadamente sus datos. Pero sí queremos reflexionar sobre una cuestión que incide directamente sobre la forma de preparar las muestras para análisis de imagen y sobre el trabajo, en tiempo y esfuerzo, que conlleva realizar las medidas morfométricas.

La pregunta sería: ¿Es más precisa la determinación tomando muchas muestras de un solo individuo o tomando muchos individuos y muchas muestras por individuos? Una respuesta muy primaria sería que la virtud está en el punto medio y se deben tomar las muestras necesarias y suficientes. Pero si reflexionamos sobre nuestras condiciones experimentales sacaremos algunas conclusiones que pueden sernos de mucho provecho.

Supongamos que vamos a realizar un análisis del efecto que cierto tratamiento produce en el diámetro de los túbulos renales. Supongamos también que el primer paso en nuestro experimento es establecer el diámetro normal de los túbulos de los riñones control. Para ello disponemos de un riñón por cada n₁ individuos normales que procesamos hasta obtener secciones histológicas en las que determinar las dimensiones de los túbulos en varios campos por sección. Buscando la máxima aleatoriedad en el muestreo, la preparación de las muestras sería:

a) cada riñón se fragmenta en n₂ rebanadas;

b) de cada rebanada se preparan n₃ bloques para cortar;

c) de cada sección se recuentan n₄ campos;

si denominamos S²_i a la varianza en cada paso, la varianza global del experimento S2 se calcularía como:

Parece claro que los denominadores de las fracciones son cada vez mayores, con lo que la contribución de cada fracción a la varianza global es cada vez menor. El término más significativo es precisamente el que depende del número de individuos que intervienen en la experiencia, como intuyen los experimentadores. Por ello debemos tener presente que el error disminuye más tomando mayor número de riñones que haciendo más recuentos por campo y riñón.

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1. Ni que decir tiene que las estructuras orgánicas sufren cierta retracción como consecuencia de la acción de los fijadores. En el ejemplo propuesto hemos obviado este efecto, aunque en los análisis de muestras fijadas siempre deberemos tener en cuenta este fenómeno.

2. Georges-Louis Leclerc, Conde de Buffon (1707-1788), nacido en Montbard, Francia, fue un notable naturalista que, además de contribuir de manera decisiva al establecimiento de las bases de lo que luego sería la Teoría de la Evolución de Darwin-Wallace, realizó importantes contribuciones en el área de la matemática. Unas de estas contribuciones ha quedado perpetuada con el nombre «Las agujas de Buffon».

3. Hally A. D. (1964): «A counting method for measuring the volumes of tissue components in microscopical sections», Quarterly Journal of Microscopical Sciencie 105: 503.