Читать книгу Возможно ли преодолеть старение? Сегодня и завтра клеточной терапии - Леонид Юрьевич Прохоров - Страница 7

Клеточный материал для получения культуры аутогенных фибробластов берут путем биопсии кожи (срез небольшого участка кожи размером примерно 0,5 см²) пациента в области предплечья или в заушной области при местной анестезии.

Получение и культивирование фибробластов из биоптата кожи проводят по стандартной методике. Для получения первичной культуры клеток ткань промывают физиологическим раствором, содержащим антибиотики, помещают в стерильную чашку Петри и обрабатывают раствором, содержащим трипсин или коллагеназу (оба ферменты). Под действием раствора ткань размягчается и из нее на дно чашки выходят живые клетки (фибробласты). Затем в чашку заливают питательную ростовую среду (см. ниже) и помещают в СО₂-инкубатор (специальный плотно закрывающийся шкаф, в котором поддерживается постоянная температура 37⁰С и повышенная концентрация (5—7%) углекислого газа в воздухе (Рис. 6); обычная концентрация СО₂ в атмосфере 0,03—0,04%, при которой фибробласты расти не могут. Клетки начинают размножаться и после заполнения всей чашки фибробластами их снимают с ростовой поверхности смесью растворов Версена (раствор ЭДТА – этилен диамин тетрауксусной кислоты и неорганических солей) и трипсина. Клетки первичной культуры центрифугируют, отмывают от компонентов раствора и суспендируют в среде культивирования.

Далее клетки переносят в культуральные флаконы (Рис. 7а и 7б), содержащие питательную ростовую среду. Ростовая среда содержит набор аминокислот, глюкозу и др. питательные вещества для клеток и 10—20% эмбриональной телячьей сыворотки (плазма крови), содержащей необходимые ростовые факторы, обеспечивающие деление клеток. Сами флаконы помещают в СО₂-инкубатор. Флаконы закрывают не плотно, а так, чтобы воздух с повышенным содержанием углекислого газа из инкубатора мог поступать внутрь флаконов. Можно использовать также флаконы с вентилируемыми крышками (с встроенным стерильным фильтром) через которые предусмотрен воздухообмен с воздухом в инкубаторе. Этим способом обеспечиваются условия для роста (деления) клеток.

Все работы проводятся в строго стерильных условиях в ламинарном шкафу (Рис. 8а и 8б), в который вентилятором через стерилизующий воздушный фильтр, расположенный сзади или сверху шкафа, под небольшим давлением нагнетается стерильный (очищенный от бактерий) воздух. За счет избыточного давления внутри ламинарного шкафа внешний воздух с бактериями внутрь не проникает, поэтому культуры клеток остаются стерильными. Работа внутри шкафа осуществляется высококвалифицированным специалистом с использованием стерильной лабораторной посуды, в том числе флаконов, пипеток, чашек Петри и др. Дополнительная стерильность осуществляется за счет обжига поверхностей посуды (горлышка флаконов, рабочих частей пипеток) в пламени спиртовой или газовой горелки, которая установлена внутри ламинарного шкафа и включена постоянно в течение всего времени работы с биологическим материалом. Сам специалист находится вне шкафа, но все действия осуществляет руками в стерильных хирургических перчатках внутри ламинарного шкафа через открытую нишу, из которой постоянно выходит стерильный воздух, не позволяющий поступать внутрь нестерильному воздуху (с бактериями) извне.

Полученные от пациентов культуры клеток используют для наработки необходимого количества клеток, достаточного для процедур (6—8 пассажей или делений клеток в культуре). Далее фибробласты тестируются на отсутствие контаминации (заражения) ВИЧ, гепатитов А, В и С, микоплазмы и хламидий. Тестирование проводится при помощи ПЦР (полимеразная цепная реакция) и иммуноферментными методами. Отсутствие онкогенных потенций клеток определяют на бестимусных (без иммунитета) мышах. Далее монослойные культуры клеток снимают с поверхности флаконов смесью растворов Версена и трипсина и суспендируют (перемешивают) с применением серологических пипеток в стерильном физиологическом растворе для инъекций. Затем 2—3 раза центрифугируют и отмывают клетки от Версена и трипсина в таком же физрастворе. Готовые суспензии сохраняют при +4⁰С. Препараты клеток используют в течение 24 часов после получения суспензии.

Жизнеспособность клеток в суспензии определяют с помощью высевания суспензионной культуры через различные сроки инкубации и подсчета количества прикрепившихся клеток, по их способности к образованию колоний.