Читать книгу HPLC optimal einsetzen - Группа авторов - Страница 53

Ein wesentlicher Unterschied in der LC-MS-Analytik im Vergleich zu konventionellen HPLC-Methoden liegt in der maximalen Flussrate, die zur Trennung verwendet werden kann. Dies liegt in der Ionenquelle des Massenspektrometers begründet, die pro Zeit nur eine begrenzte Menge an mobiler Phase in die Gasphase überführen und quantitativ von den Analytmolekülen entfernen und von dem Innenleben des Massenspektrometers fernhalten kann. Elektrosprayionisation (ESI), die in über 80 % aller publizierten Online-LC-MS-Kopplungen eingesetzt wird (gefolgt von AP-CI mit über 16 %), lässt sich mit pneumatischer Unterstützung eines Vernebelungsgases im Flussbereich von etwa 50–300 μl/min bei bestmöglicher Empfindlichkeit betreiben. Alle kommerziellen ESI-Quellen (mit Ausnahme von Nanosprayquellen) verkraften auch deutlich höhere Flussraten von bis zu 1 ml/min und darüber, wobei zahlreiche Beispiele in der Literatur belegen, dass die Empfindlichkeit von ESI-Methoden erst dann zu leiden beginnt, wenn es nicht mehr gelingt, die Menge an mobiler Phase effektiv zu entfernen, es mithin „die eine“ magische Obergrenze der Flussrate in der LC-MS-Analytik nicht gibt. Viele LC-MS-Analytiker:innen setzen trotzdem lieber auf eine konservativ niedrige LC-Flussrate bis maximal 300–500 μl/min, statt sich an der optimalen Lineargeschwindigkeit für die gegebenen LC-Trägerpartikel, sprich, dem Minimum der van-Deemter-Kurve, zu orientieren. Um die LC-Trennung dennoch möglichst effizient zu betreiben, überschreiten die Säuleninnendurchmesser für LC-MS-Applikationen deshalb 2,1 mm nicht. Eine UHPLC-Säule dieses Durchmessers und eines mittleren Teilchendurchmessers des Phasenmaterials d_p von 2 μm hat ihre optimale Lineargeschwindigkeit in grober Näherung bei rund 5,5 mm/s, was bei einer 2,1 mm-ID-Säule bereits einer Flussrate von etwa 1,1 ml/min entspricht. In der Praxis reduzieren viele LC-MS-Anwender:innen diese Flussrate, um die Trocknungsleistung der Ionenquelle nicht zu überfordern, auch wenn die LC-Trennung dann bereits mit tendenziell zu hohem Einfluss der Longitudinaldiffusion (B-Term) gefahren wird. Eine Reduktion des Säuleninnendurchmessers auf 1 mm wird aus mehreren Gründen kontrovers diskutiert, auch wenn sich viele Anwender:innen von dem kleineren Innendurchmesser eine niedrigere Nachweisgrenze versprechen, da die Probenmoleküle in einem kleineren Peakvolumen verdünnt würden. Eine ausführlichere Erörterung dieser Problematik kann der Literatur entnommen werden [2]. Kurz gesagt kann mit konzentrationsempfindlichen Detektoren (insbesondere ESI wird als bevorzugt konzentrationsempfindlicher Prozess beschrieben) bei Anwendung der Skalierungsgesetze der Chromatographie auf einer 2,1 mm-ID-Trennsäule dieselbe Nachweisgrenze erreicht werden wie auf einer 1 mm-ID-Trennsäule, sofern man das 4,4-fache Probenvolumen injiziert. Technisch sind Trennungen auf 2,1 mm-ID-Säulen allerdings robuster als jene auf 1 mm-ID-Säulen, was sowohl am verwendeten Säulenmaterial als auch an der begrenzten Eignung von UHPLC-Systemen für sehr niedrige Flussraten von weniger als 50 μl/min liegt. Damit bleiben für die Verwendung von 1 mm-ID-Trennsäulen nur zwei Gründe übrig: Man ist entweder derart limitiert in der Probenmenge, dass Injektionsvolumina von 4–5 μl pro Messung zu viel Probenmenge verbrauchen, oder die MS-Ionenquelle beschränkt den Anwender tatsächlich auf Flussraten von etwa 100 μl/min oder weniger. Letzteres kommt in der Praxis allerdings selten vor. Kommerzielle ESI-Quellen mit pneumatischer Vernebelung kommen in der Regel mit Flussraten bis zu 600–700 μl/min ohne Einbußen in der Empfindlichkeit gut zurecht. APCI ist mit höheren Flussraten prinzipbedingt noch besser kompatibel, da es einer Mindestflussrate von etwa 200 μl/min bedarf, um ausreichend Eluent zur Bildung des Reaktantgases in der APCI-Quelle zu verdampfen.