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Nach der erfolgreichen Optimierung der Ionenquelleneinstellungen, die die höchste Ausbeute an gewünschten Ionenaddukten zum Ziel hat, steht als nächstes die Einstellung des Massenselektors und -detektors auf höchste Empfindlichkeit an. Die genauen Einstellparameter variieren dabei je nach Bautyp des Massenspektrometers und nach Hersteller. Allen gemein ist die Aufgabe der elektrischen Optik im Mittel- und Hochvakuumbereich des Massenspektrometers. Vor dem eigentlichen Massenanalysator befindet sich eine Ionenoptik, die zwei Ziele verfolgt: die möglichst vollständige Abtrennung von Neutralmolekülen, Lösemittelresten und Restgas sowie die konvergente Bündelung des Analytionenstrahls. Die Ionenoptik besteht meist aus diversen Multipolen (Quadrupol, Hexapol, Oktapol u. a.), alternativ aus einem Ionentrichter (engl. Ion Funnel) als gestaffelte Folge von Fokussierungslinsen, diversen Umlenkeinrichtungen (z. B. gekrümmte Multipole) und Beschleunigungselektroden in der Form von Prallplatten mit schmaler mittiger Durchlassöffnung (Skimmer). Angesichts der Vielfalt von Bautypen ist es nicht sinnvoll, hier eine allgemeine Optimierungsreihenfolge zu beschreiben, zumal die Optimierungen von der Art des Bauteils und seiner Position entlang der Ionenflugstrecke abhängen. Gleiches gilt für den Massenanalysator selbst; gestaffelte Quadrupole erfordern nachvollziehbarerweise andere Einstellungen als Ionenfallen, Orbitraps oder Flugrohre. Änderungen an den Parametern des Massenanalysators und des dahinter befindlichen Ionendetektors (sofern vorhanden) bestimmen die Massengenauigkeit (sie wird im Rahmen der Kalibrierung optimiert) mehr als die Empfindlichkeit. Daher werden diese Einstellungen meist universell für einen bestimmten Massenbereich optimiert, nicht aber für jedes individuelle LC-MS-Analysenproblem. Zur bestmöglichen Ionenfokussierung und für einen maximalen, selektiven Ionentransfer in den Massenanalysator geben die Herstellerhandbücher in der Regel ausführlich Auskunft und geeignete Hilfestellung. In der Praxis hat sich jedoch gezeigt, dass es sich nur in wenigen Fällen diese MS-intrinsischen Parameter zu optimieren lohnt, z. B. wenn im Forschungsumfeld die Nachweisgrenze eines Expertensystems auf das Letzte ausgereizt werden muss. Im industriellen Routineeinsatz lohnt der Zeitaufwand der Optimierung oft den Gewinn an Empfindlichkeit nicht.

Zum Abschluss der MS-Optimierung empfiehlt es sich, die Infusion der Tuninglösung mit den optimierten Einstellungen für 1–5 min kontinuierlich als einen Referenzdatensatz aufzuzeichnen. Diesen begutachtet man anschließend bezüglich der Spray- bzw. Signalstabilität und ermittelt sowohl aus der LC-MS-Datenspur das Basislinienrauschen als auch aus einem repräsentativ gemittelten Satz an MS-Spektren die Qualität des Spektrums hinsichtlich Verunreinigungen und Form der Massensignale, das Signal-zu-Rauschen für die charakteristischen Isotopensignale, die Verteilung der Isotopenintensitäten sowie die erzielte Massenauflösung. Bei HR/AM- Messungen sollte zudem die Massengenauigkeit als Maß der Abweichung zwischen theoretischer und experimentell gemessener Masse in ppm bestimmt werden.