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Dieses erste Anwendungsbeispiel, das aus der Arbeit von Koshel et al. stammt, verwendet eine einzelne 2D-LC-Heartcut-Methode zur Identifizierung einer Verunreinigung in einem synthetischen Oligonukleotid mittels Massenspektrometrie [29]. In der Vergangenheit war die Identifizierung solcher Verunreinigungen durch MS schwierig, da die hohen Konzentrationen langkettiger aminhaltiger Ionenpaar-Reagenzien, die für RP-Trennungen von Oligonukleotiden verwendet werden, mit der MS-Detektion nicht gut kompatibel sind. Die in Abb. 1.5a gezeigte 2D-LC-Methode ermöglicht jedoch die Trennung der Verunreinigung vom Zieloligonukleotid durch die 1D-Säule und die anschließende Trennung der Verunreinigung von langkettigen Ionenpaar-Reagenzien durch die 2D-Säule vor der Detektion. In diesem Fall wird in beiden Dimensionen die gleiche RP-Säulenchemie verwendet. Obwohl dies bei 2D-LC-Trennungen im Allgemeinen ungewöhnlich ist, ist es hier wirksam, weil die in der ersten und zweiten Dimension verwendeten Ionenpaar-Reagenzien chemisch recht unterschiedlich sind (Hexylamin vs. Triethylamin + Hexafluorisopropanol) und zu unterschiedlichen Selektivitäten führen. Die wichtigen Parameter für die Trennung sind in Tab. 1.1 dargestellt. Die 1D- und 2D-Fließgeschwindigkeiten sind ähnlich; dies ist möglich, da es sich um eine einfache Heartcut-Methode handelt und die Geschwindigkeit der 2D-Trennung nicht kritisch ist. Eine einzelne 50 μl-Fraktion des 1D-Eluats (0,5 min × 0,10ml/min) wird nach der Verdünnung mit wässrigem Elutionsmittel mittels der 2D-Pumpe auf die 2D-Säule übertragen. Dieser Verdünnungsschritt ist wichtig, da er den Gehalt an organischem Lösungsmittel der in die 2D-Säule injizierten Probe reduziert, was zu einer ausgezeichneten Peakform im 2D-Chromatogramm führt, wie in Abb. 1.5b dargestellt.

Abb. 1.5 Identifizierung einer Verunreinigung in einem synthetischen farbstoffmarkierten Oligonukleotid unter Verwendung von LC-LC mit RP-Säulen in beiden Dimensionen. Die Verwendung unterschiedlicher Ionenpaarbedingungen in den beiden Dimensionen Hexylamin für die UV-Detektion, siehe (a), sowie Triethylamin + Hexafluorisopropanol für die MS-Kopplung, siehe (b), sorgt für eine komplementäre Selektivität, obwohl die Säulenchemie dieselbe ist, und macht die 2D-Trennung für den Nachweis durch Massenspektrometrie geeignet. Abdruck mit Genehmigung aus [29].