Читать книгу HPLC optimal einsetzen - Группа авторов - Страница 34

In diesem zweiten Beispiel untersuchen wir die Verwendung von LC × LC zur Abtrennung von Tween 20 (auch bekannt als Polysorbat 20 oder PS20), einer komplexen Mischung von Fettsäureestern von ethoxyliertem Sorbitan. Der umfassende Modus von 2D-LC ist eindeutig am besten geeignet, um eine komplexe Mischung wie diese zu charakterisieren. Die in Abb. 1.6 gezeigte Trennung, die aus der Arbeit von Vanhoenacker et al. stammt [30], ist eine schöne Demonstration, wie sich HILIC- und RP-Trennungen bei der Verwendung in einem 2D-Trennformat gut ergänzen können. Unter den Bedingungen dieser Trennung trennt die 1D-HILIC-Säule die Moleküle in erster Linie auf der Grundlage der Anzahl der vorhandenen Oxyethylengruppen, wobei höher ethoxylierte Moleküle später in der ersten Dimension eluiert werden. Die 2D-RP-Säule hingegen trennt die Moleküle in erster Linie auf der Grundlage der Länge und der Anzahl der vorhandenen Fettsäureestergruppen. Eine Zusammenfassung der für diese Trennung verwendeten Bedingungen ist in Tab. 1.2 dargestellt. Die 1D-Säule wird mit einer Flussrate betrieben, die für eine 2,1 mm-i. d.-Säule als niedrig angesehen wird (30 μl/min), in erster Linie, damit das Volumen des in die 2D-Säule injizierten 1D-Eluats nicht zu groß ist (20 μl). Dies ist hier besonders wichtig, weil jede dieser Fraktionen mehr als 75 % organisches Lösungsmittel enthält, während jede 2D-Trennung mit 60 % organischem Lösungsmittel beginnt, und das meiste dieser organischen Stoffe ist MeOH, das für RP-Trennungen ein schwächeres Lösungsmittel als ACN ist. Eine Erhöhung der 1D-Flussrate und damit des Volumens des 1D-Eluats, der mit jeder Fraktion in die 2D-Säule injiziert wird, würde zu einer starken Verbreiterung der 2D-Peaks führen.

Tab. 1.1 Zusammenfassung der Bedingungen für die IPRP-IPRP-Trennung von farbstoffmarkierten Oligonukleotiden.

Erste Dimension Säule: RP (C18); 50 mm × 2,1 mm i. d., 1,7 μm Gradientenelution von 66 bis 76 % B Lösungsmittel A: 100 mM Hexylamin-Acetat, pH 7 Lösungsmittel B: MeOH Durchflussrate: 0,10 ml/min Temperatur: 60 °C Injektionsvolumen: 1 μl Analysezeit: 30 min

Zweite Dimension Spalte: RP (C18); 50 mm × 2,1 mm i. d., 1,7 μm Gradientenelution von 20 bis 70 % B Lösungsmittel A: 15 mM Triethylamin, 400 mM Hexafluorisopropanol in Wasser, pH 8 Lösungsmittel B: MeOH Durchflussrate: 0,25 ml/min Temperatur: 60 °C Analysezeit (pro Fraktion): 20 min.

Schnittstelle Doppelte Ventile mit sechs Anschlüssen, mit direkter Überführung der Fraktion in die 2D-Säule

Die 2D-Säule ist relativ kurz (50 mm), schmal (2,1 mm i. d.) und mit kleinen Partikeln (1,8 μm) gepackt, was die in der zweiten Dimension erforderlichen schnellen Trennungen begünstigt. Die Säulentemperatur beträgt 80 °C, was die Verwendung einer für diese Säule als hoch angesehenen Flussrate (2 ml/min) erleichtert [31]. Es werden steile Gradienten verwendet, sodass die Dauer jedes 2D-Zyklus nur 33 s beträgt, was dazu beiträgt, das Undersampling zu minimieren und die Trennung der 1D-Peaks, die von der 1D-Säule vor der Probenahme bereitgestellt werden, aufrechtzuerhalten.

Abb. 1.6 Trennung der Bestandteile von kommerziellem PS20 mittels LC × LC mit HILIC- und RP-Säulen in der ersten bzw. zweiten Dimension. Angepasst mit Genehmigung nach [30].