Читать книгу HPLC optimal einsetzen - Группа авторов - Страница 43

Salze werden der mobilen Phase typischerweise zugesetzt, um die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen geladenen Analyten und der stationären Phase kontrollieren zu können. Normalerweise führt dies dadurch auch zur Verbesserung der Peakform der eluierenden Analyten durch geringeres Peak-Tailing. Normalerweise werden zur Nutzung von massenspektrometrischer Detektion in der HILIC ausschließlich Salze wie Ammonium-Acetat und Ammonium-Formiat eingesetzt, manchmal auch Ammonium-Bikarbonat. Diese Salze lösen sich sehr gut in Laufmittel mit hohen Acetonitril-Gehalten und sind gleichzeitig flüchtig genug, um im Ionisationsprozess des Massenspektrometers entfernt werden zu können. Die Nutzung von weniger gut löslichen Salzen, wie Phosphaten oder Ionenpaarreagenzien, wie TFA, sollten nach Möglichkeit vermieden werden.

Abb. 2.6 Trennung von 2-Hydroxy- und 4-Hydroxybenzoesäure (Molekül 1 bzw. 2) in Chromatogrammen mit Retention und Performance auf drei stationären Phasen gezeigt. Die Untersuchungen erfolgten in einem isokratischen Lauf bei 10 mM Ammonium-Acetat im wässrigen Laufmittel (obere Chromatogramme) und 15 mM Ammonium-Acetat (untere Chromatogramme). Diese Abbildung wurde verändert und genutzt aus ursprünglich [6].

Die zwei Salze Ammonium-Acetat und Ammonium-Formiat sind nicht identisch einsetzbar, denn Ammonium-Formiat ergibt in der mobilen Phase einen stärker sauren pH-Wert als Ammonium-Acetat. Dies lässt allerdings die Nutzung einer Mischung aus beiden Salzen in der Trennung bei unterschiedlichen pH-Werten zu. Ammonium-Bikarbonat enthaltende Lösungen sind nicht zu empfehlen, denn diese sind sehr instabil. Durch Ausdampfen von Kohlenstoffdioxid verändert sich zum einen der Salzgehalt und zum anderen auch der pH-Wert (bis hin zum Basischen).

Im Gegensatz zur RPLC hat der Salzgehalt im HILIC-Laufmittel direkt einen großen Einfluss auf die Retentionszeit von Analyten (siehe hier auch die Chromatogramme in Abb. 2.6, bei denen zwischen oberen und unteren lediglich ein Unterschied von 5 mM Ammonium Acetat im Laufmittel vorliegt). Der prinzipielle Effekt der Erhöhung des Salzgehaltes in der mobilen Phase ist die Erniedrigung der elektrostatischen Wechselwirkungen im Falle von geladenen Molekülen mit geladenen oder zwitterionischen Säulenmaterialien (siehe auch [2]). Im Falle von elektrostati scher Anziehung zwischen Analyten und stationärer Phase führt dies zu einer verringerten Retention, wobei es im Falle von elektrostatischer Abstoßung zu erhöhter Retention des entsprechenden Analyten führt.

Der zweite Effekt einer Erhöhung des Salzgehaltes in der mobilen Phase zeigt sich in der Schichtdicke der Wasserschicht auf der Oberfläche von HILIC-Materialien. Der hohe Gehalt an organischem Lösungsmittel zwingt das Salz zur bevorzugten Anreicherung in der Wasserschicht. Eine zunehmende Salzkonzentration führt somit zu einer zunehmenden Schichtdicke der Wasserschicht, was einhergeht mit einer stärkeren Retention sämtlicher polarer Analyten. Aus diesem Grund bewirkt ein signifikant erhöhter Salzgehalt für polare nicht geladene Analyten auch ohne die elektrostatische Wechselwirkung eine erhöhte Retention.

Salze in der HILIC-Trennung haben auch noch weitergehende Eigenschaften. Ein jüngst durch A. Alpert beschriebener Effekt ist die sogenannte Aussalzung von Kationen bei sehr starker Erhöhung des kosmotropischen Salzgehaltes und überlagert die verlängerte Retention in der stärkeren Wasserschicht [10]. Laut den Beschreibungen zur Aussalzung von Alpert, aber auch von Jandera [11] können generell höhere Salzgehalte sowohl zu höheren Retentionszeiten wie auch zu niedrigeren Retentionszeiten führen, was die einfache Interpretation und Nutzung von Salzanwendung letztlich erschwert. Da diese Studien aber überwiegend mit nichtflüchtigen Salzen erfolgt sind, sei dieser Effekt hier nur erwähnt.

Wichtig bleibt jedoch festzuhalten, dass der Salzgehalt im Laufmittel grundsätzlich sehr stabil bzw. reproduzierbar gehalten werden sollte, um so die Eigenschaften der Wasserschicht bzw. der adsorptiven Wechselwirkungen während eines Laufes nicht oder aber sehr reproduzierbar zu ändern.