Читать книгу Temas selectos en ecología química de insectos - Julio C. Rojas - Страница 7
ОглавлениеE. A. MALO RIVERA y J. C. ROJAS. 2012. Métodos de Investigación en Semioquímicos, 17-45. En: J. C. ROJAS y E. A. MALO (eds.). Temas Selectos en Ecología Química de Insectos. El Colegio de la Frontera Sur. México. 446 p.
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Métodos de Investigación en Semioquímicos
EDI A. MALO RIVERA Y JULIO C. ROJAS
Departamento de Entomología Tropical, El Colegio de la Frontera Sur, Carretera Antiguo Aeropuerto km 2.5, Tapachula, Chiapas, México.Correo electrónico: emr@ecosur.mx
Resumen. En este capítulo abordamos las técnicas utilizadas en la colecta, análisis e identificación de semioquímicos con la finalidad de contribuir a un mejor conocimiento de éstas y de hacerlas más entendibles tanto para estudiantes como para personal técnico que trabajan en ecología química y en otras especialidades relacionadas. Algunas de estas técnicas han tenido un rápido desarrollo que ha permitido que a la fecha con unos cuantos insectos se logre la identificación de una feromona a diferencia de los miles de insectos requeridos en el pasado. Las técnicas instrumentales usadas en la identificación de compuestos son abordadas en este capítulo de manera general, ya que no pretendemos escribir sendos tratados sobre estas técnicas, pues existen libros en inglés que lo hacen a profundidad.
Introducción
La comunicación química juega un importante papel en casi todos los aspectos de la vida de los insectos, incluyendo la localización de alimento y parejas potenciales, y en la detección de depredadores, entre otras funciones. Los compuestos químicos conllevan una cantidad asombrosa de información, así que uno de los mayores retos es determinar cómo ocurre la comunicación entre los diferentes individuos y su ambiente. Los insectos y plantas liberan compuestos volátiles que pueden afectar la fisiología y comportamiento de los insectos. En años recientes ha habido un gran interés en identificar los volátiles emitidos por insectos y plantas, y entender su efecto en las interacciones intraespecíficas (p. ej. macho-hembra, reina-obrera) e interespecíficas (p. ej. planta-planta, planta-insecto herbívoro, planta-insecto herbívoro-parasitoide).
La identificación de la primera feromona sexual de un insecto, producida por las hembras del gusano de seda para atraer a los machos, fue anunciada por el químico alemán Adolf Butenandt en 1959 (Hecker & Butenandt, 1984). Este investigador ganó el premio Nobel de química en 1939 por haber identificado las hormonas sexuales humanas, estrona, progesterona y testosterona. La identificación de la primera feromona de un insecto fue una tarea bastante difícil ya que para lograrlo se tuvieron que disecar lotes de hasta 500,000 abdómenes de las hembras de Bombyx mori para tener el material suficiente para aislarla en cantidades apropiadas y elucidar su estructura química. Básicamente para el aislamiento de la feromona se usó cromatografía en columna y en capa fina con sílica gel. La elucidación de la estructura de la feromona se logró usando análisis por espectrometría UV, espectrometría de infrarrojo y microrreacciones. Sin embargo, para ver si la estructura era la correcta fue necesario sintetizar la molécula en sus cuatro posibles configuraciones (Z o E) y evaluarlas en bioensayos comportamentales. La feromona fue identificada como (E-10, Z-12) hexadecadienol, bombicol, y el trabajo para identificarla tomó dos décadas.
Actualmente gracias al importante desarrollo en las técnicas analíticas modernas es posible identificar un semioquímico en un tiempo menor y con menos material biológico de lo que se usó para identificar la primera feromona. En este capítulo describiremos una serie de métodos de colecta de muestreo, de aislamiento e identificación de semioquímicos, con énfasis en los compuestos volátiles.
Métodos de muestreo de semioquímicos
En esta sección haremos una breve descripción de los métodos usados para el muestreo y la concentración de compuestos volátiles y no volátiles. Básicamente los compuestos pueden ser extraídos sumergiendo una parte del insecto (p. ej. glándula) o planta (p. ej. hoja, raíz) en un disolvente o muestreando la fase gaseosa (“headspace”) alrededor del organismo. Cuando hacemos una extracción con disolventes podemos extraer compuestos volátiles y no volátiles. El muestreo puede ser estático o dinámico, en ambos casos los volátiles son desorbidos con algún disolvente o mediante calentamiento. La selección del método dependerá del problema biológico y del material que se desea investigar. Por ejemplo, si deseamos evaluar la actividad biológica de algún extracto, entonces debemos hacer la extracción con disolventes o usando un método de aeración en donde los volátiles atrapados puedan ser eluídos con disolventes.
Extracción con disolventes
En este método los compuestos de interés pueden ser extraídos sumergiendo los tejidos del material biológico en estudio en un disolvente por un determinado tiempo o bien pueden ser extraídos con un Soxhlet. El tiempo de extracción dependerá del tipo de compuestos que deseemos extraer. Por ejemplo, si queremos extraer los lípidos cuticulares de un tejido, entonces con sumergir el material unos cuantos segundos o minutos será suficiente, pero si estamos interesados en extraer compuestos internos de los tejidos, entonces el material deberá permanecer en el disolvente varias horas o días. En algunos casos se calienta el disolvente para acelerar el proceso de extracción, esto se hace cuando se intenta extraer compuestos no volátiles o compuestos que no se degradan con el calor. El método de extracción con disolvente ha sido ampliamente usado para extraer las feromonas sexuales de lepidópteros, básicamente consiste en estrujar el cuerpo de la hembra, de tal forma que expongan los últimos segmentos abdominales en donde se encuentran las células productoras de la feromona, los cuales son cortados y sumergidos en un pequeño vial conteniendo 200 μL de hexano o cloruro de metileno durante minutos a una hora. Entre menos tiempo permanezca el tejido en el disolvente, menos posibilidades habrá de extraer lípidos, que pueden interferir con el análisis químico de los extractos. Este método también ha sido usado ampliamente para extraer hidrocarburos cuticulares y metabolitos secundarios de las plantas que mediatizan el comportamiento de alimentación y oviposición de los insectos. Cuando se use este método se debe tener cuidado de utilizar un disolvente limpio grado HPLC y lavar perfectamente los recipientes de vidrio utilizados para la extracción.
Muestreo de volátiles
En esta sección describiremos brevemente los métodos para muestrear los compuestos volátiles.
Aireación dinámica
La aeración dinámica es el método más usado para muestrear los volátiles emitidos por insectos y plantas. Este método consiste en pasar un flujo de aire para arrastrar los compuestos volátiles emitidos por el organismo, el cual está contenido dentro de un recipiente y capturarlos en filtros con adsorbentes (Heath & Manukian, 1992). Los recipientes usados para contener el material a muestrear pueden ser de vidrio o de plástico, los primeros tienen menores niveles de impurezas, pero son más caros y frágiles, los segundos son más versátiles y pueden ser muy útiles para la captura de volátiles de plantas en el laboratorio y en campo. Se han usadas bolsas de diversos materiales en diferentes trabajos, incluyendo polietileno, poliéster, poliacetato, polietileno de tereftalato y polivinilacetato (Stewart-Jones & Poppy, 2006). También diferentes adsorbentes para la captura de volátiles de insectos y plantas, los más utilizados son Porapak Q, Super Q, Tenax y carbón activado. Algunos adsorbentes como Porapak Q o Tenax necesitan ser tratados antes de usarse debido a las impurezas que contienen o bien usar versiones más limpias de estos adsorbentes tales como Super Q y Tenax TA. El tratamiento de los adsorbentes consiste en colocarlos dentro de un tubo de vidrio y calentarlos a 200 (Porapak Q) o 270-340 ºC (Tenax) durante varias horas pasando un flujo de N2 dentro del tubo para evitar que el adsorbente se queme, posteriormente el adsorbente es lavado con pentano, cloruro de metileno o éter usando un Soxhlet (Millar & Sims, 1998). Los adsorbentes son usualmente contenidos o empacados dentro de tubos de vidrio (p. ej. una pipeta Pasteur) con lana de vidrio o malla metálica. Los tubos empacados con adsorbente pueden ser obtenidos de casas comerciales tales como SKC y ARS en los EUA, la primera compañía tiene distribuidores en varios países de Latinoamérica y la segunda puede ser fácilmente contactada vía Internet. El aire que arrastra los compuestos volátiles pasa a través del adsorbente a una tasa de flujo constante durante el proceso de muestreo.
Los sistemas de colecta que muestrean los volátiles por aeración dinámica pueden ser cerrados o abiertos (Tholl et al., 2006). En el sistema del primer tipo, conocido en inglés como “closed-loop stripping”, el aire junto con los volátiles emitidos por el organismo se hacen circular mediante una bomba de diafragma y capturados en el adsorbente dentro de una cámara cerrada (p. ej. desecador de vidrio de 750mL) (Seidelmann et al., 2000) (Figura 1). Los contaminantes son minimizados debido a que el aire circula dentro de un ambiente cerrado. Los volátiles atrapados pueden ser recuperados con disolventes o termodesorbidos. Un modelo comercial de este sistema es vendido por Brechühler AG, una compañía de Suiza. Este sistema ha sido usado para muestrear feromonas de insectos y volátiles vegetales inducidos por herbivoría y volátiles florales (Bestmann et al., 1988; Tholl et al., 2006).
Figura 1. Técnica de colecta de volátiles “closed-loop-stripping” usada con langostas. 1. Baño maría; 2. Desecador; 3. Refrigerante para enfriamiento; 4. Sistema de calentamiento; 5. Filtro de carbón activado; 6. Flujómetro; 7. Carbón activado; P. Bomba (tomada de Seidelmann et al. 2000).
En la colecta de volátiles por aeración dinámica abierta se puede extraer o empujar-extraer el aire del exterior dentro de la cámara de colecta (Tholl et al., 2006). En un sistema del tipo “extraer” se usa una bomba de vacío conectada a un flujómetro que a su vez se conecta al tubo con el adsorbente que atrapará los volátiles jalados por la bomba. El material a muestrear se coloca en un recipiente abierto o cerrado, en el primer caso hay un mayor riesgo de colectar impurezas del ambiente, el cual es minimizado al contener el material dentro de un recipiente de vidrio o una bolsa. En este caso, el aire del ambiente entra al recipiente a través de un filtro de carbón activado y es retirado de éste al extraer un volumen definido a través del tubo con el adsorbente. En un sistema del tipo “empujar-extraer”, el aire del exterior es primeramente purificado por una trampa de carbón activado, y después pasa por un flujómetro que regula el volumen de aire que entra al recipiente, el aire junto con los volátiles es extraído hacia el tubo con el adsorbente a un volumen menor al que ingresó por medio de otro flujómetro, el cual es conectado a la bomba de vacío.
Otro método de aeración dinámica es el llamado análisis por desadsorción térmica y purga-trampa (Figura 2), aunque su uso en ecología química ha sido limitado (Millar & Sims, 1998). La técnica consiste en colocar el material a muestrear en un recipiente y los compuestos volátiles son arrastrados por aireación y capturados en un adsorbente. El adsorbente que contiene los volátiles es purgado con un gas inerte (para remover agua, principalmente) y desadsorbido por calentamiento directamente en un cromatógrafo de gases. Una desventaja a considerar con este método es la posible formación de contaminantes debido a la degradación de la muestra o del adsorbente por calor (Millar & Sims, 1998). En el mercado existen varios modelos comerciales para el análisis purga-trampa (Supelco, Scientific Instrument Services, Perkin Elmer, Carlo Erba, Tekmar). Una de las aplicaciones de esta técnica fue en el análisis de atrayentes de fruta fermentada o madura (Cossé et al., 1995). Posteriormente, Drijfhout et al. (2000) reportaron la aplicación de la desadsorción térmica en el análisis de la feromona sexual de Adoxophyes orana (Lepidoptera: Tortricidae) and Campylomma verbasci (Heteroptera: Miridae) a partir de un solo insecto mediante esta técnica.
Métodos de muestreos de compuestos volátiles de manera estática
Esta técnica permite lograr un equilibrio entre la muestra y su espacio aéreo y entonces un volumen de la muestra es inyectada directamente al cromatógrafo de gases para su análisis. La cantidad de analito transferido al instrumento es proporcional al volumen de la fase gaseosa y a la concentración del analito (Pawliszyn, 1997).
Figura 2. Técnica de captura de volátiles por desorción térmica (TDS). 1. Sistema de desorción térmica; 2. Parte de horno de TDS; 3. Tubo TDS; 4. Flujo de gas (hidrógeno); 5. Línea de transferencia, (300 °C); 6. Inyector PTv; 7. FID; 8. GC (tomada de Drijfhout et al. 2000).
Muestreo del espacio aéreo con una jeringa. la manera más simple de la técnica consiste en el muestreo directo de volátiles del espacio aéreo de una muestra equilibrada en un recipiente cerrado. Una alícuota (100-1000 µL) de los gases del espacio aéreo es removida con una jeringa e inyectada directamente al equipo. Este método es recomendado solamente con compuestos cuyas concentraciones y presión de vapor son altas para proveer al menos cantidades de nanogramos en la alícuota (Millar & Sims, 1998).
Microextraccion en fase sólida (MEFS). Es una técnica simple y efectiva de adsorción-desadsorción que no requiere de disolvente y fue desarrollada en la Universidad de Waterloo en Ontario, Canadá (Arthur et al., 1992). La MEFS consiste de una jeringa de gases modificada, conteniendo una fibra de sílica fundida de 1 cm, cubierta con un determinado polímero (Figura 3) (véase página de Sigma-Aldrich para mayor información sobre la elección de la fibra), el cual está adherido a una pequeña barra de acero inoxidable e instalado en el émbolo de una jeringa de gases. La fibra de la jeringa es previamente acondicionada a 150 ºC, haciéndole pasar un flujo de nitrógeno. Posteriormente es introducida a través de un septo en el recipiente que contiene la muestra para capturar los volátiles durante un periodo de tiempo que puede variar dependiendo de varios factores tales como el tipo de fibra, la concentración de los volátiles y la temperatura de muestreo, entre otros (Pawliszyn, 1997). Después del muestreo, la fibra es colocada directamente en el inyector del cromatógrafo, en donde los compuestos volátiles son desadsorbidos térmicamente y transportados por el gas de arrastre hacia la columna. La fibra, previamente limpiada, puede ser re-utilizada hasta 100 veces, aproximadamente. Esta técnica ha sido utilizada con buenos resultados en la identificación de la feromona de Metamasius hemipterus (Malosse et al., 1995) y Phyllonorycter sylvella (Borg-Karlson & Mozuraitis, 1996), y de volátiles de plantas (Tholl et al., 2006). Recientemente se han hecho modificaciones a esta técnica, encontrándose que un lápiz hecho en casa con fibra de plomo extrajo hasta 1000 veces más volátiles de insectos que la fibra comercial de polidimetilsiloxano (PDMS) (Djozan et al., 2005).
Figura 3. Jeringa y fibra adsorbente para la colecta de volátiles por micro extracción en fase sólida (SPME) (Tomada de Supelco).
Extracción por adsorción en barra agitadora. Esta técnica surgió debido a las limitaciones que presenta la MEFS con respecto a su baja eficiencia de extracción. La fase de extracción usada en este método es la misma que se usa en la MEFS, PDMS, pero las barras son recubiertas con 50 a 250 veces más cantidades del polímero. Por ejemplo, una barra de 10 mm tiene 5 µL de PDMS y una de 40 mm tiene 219 µL del polímetro, mientras que una fibra de MESF tiene menos de 0.5 µL de PDMS. Después de un cierto tiempo de exposición, la barra agitadora es removida, introducida a un tubo de vidrio y transferida a un instrumento de desadsorción térmica donde los compuestos son liberados térmicamente y transferidos al equipo (Baltussen et al., 1999). Adicionalmente, los compuestos también pueden ser desadsorbidos usando un disolvente. Debido a la fase usada, esta técnica sólo extrae compuestos no polares y pocos polares. Los compuestos polares pueden ser extraídos después de derivatizarlos mediante reactivos específicos y analizados posteriormente. Hasta ahora existen pocos ejemplos de este método de extracción de volátiles de insectos y plantas (Scascighini et al., 2005), ya que básicamente se ha usado para la extracción y concentración de compuestos de matrices líquidas, pero podría ser más usado en el futuro debido a su mayor sensibilidad en comparación con la MEFS. Recientemente, un grupo de investigadores aislaron compuestos de agua de criaderos de mosquitos usando este método de extracción, estos compuestos atraen a las hembras de los mosquitos a los sitios de oviposición (Carson et al., 2010). Una versión comercial de este sistema con el nombre de “Twister” puede ser adquirida de la compañía Gerstel, Alemania, que tiene distribuidores en varios países de América Latina.
Muestreo de volátiles de modo pasivo/difuso
Esta tecnología fue desarrollada para monitorear la calidad del aire, pero un trabajo reciente ha mostrado que puede ser usada para muestrear los volátiles de árboles de manzana en el campo (Vallat et al., 2005), por lo que podría tener aplicaciones en el área de la ecología química en un futuro cercano. El muestreo pasivo depende de la difusión molecular de los analitos a través de una superficie difusa sobre un adsorbente. Este sistema no necesita de electricidad, es simple de usar y es relativamente barato. Después del muestreo, los analitos adsorbidos pueden ser desadorbidos con un disolvente o con calor. Una versión comercial de este muestreador de volátiles, conocido como Radiello, puede ser conseguida a través de Supelco.
Evaluación comportamental
Aparatos para medir la respuesta de insectos a semioquímicos en el laboratorio
Cualquier aparato usado para determinar la respuesta cualitativa o cuantitativa de un insecto a un determinado olor es conocido generalmente como una arena, un olfatómetro o un túnel de vuelo. La primera pregunta a la que se enfrenta un estudiante o investigador que desea evaluar la actividad biológica de un extracto o un compuesto sintético es ¿qué tipo de aparato debo usar? Indudablemente la elección o diseño del aparato es de crucial importancia para la determinación de la actividad biológica, y la decisión deberá ser tomada considerando varios factores, entre los que destaca el comportamiento del insecto que se desea evaluar, el tamaño del insecto, si vuela o no, si es de hábitos nocturnos o diurnos, etc.
Cualquiera que sea su diseño, un aparato debe cumplir con los siguientes requerimientos: 1) la evaluación de las muestras debe ser simple y rápida en un tiempo limitado; 2) fácil observación de los actos comportamentales a estudiar, por ejemplo, vuelo al azar, vuelo dirigido, aterrizaje; y 3) fácil control y prevención de la contaminación causada por un estimulo previo (Schreck et al., 1981). Tradicionalmente, los aparatos han sido clasificados en dos grandes grupos, los que no usan aire y aquellos que usan aire para transportar a las moléculas odoríferas (Baker & Linn, 1984; Baker & Cardé, 1984). Antes de intentar copiar cualquier aparato es aconsejable revisar cuidadosamente la información que ha sido obtenida usando dicha arena, olfatómetro o túnel de vuelo, para ver si se adapta a nuestras necesidades (Finch, 1986).
Olfatómetros sin aire
Existen una gran variedad de diseños, pero fundamentalmente en estos olfatómetros, los insectos encuentran a la fuente de olor a una corta distancia o al contacto, debido a que los compuestos volátiles son dispersados por simple difusión. El diseño más simple de este tipo de olfatómetro es una caja Petri, pero existen otros modelos más complejos. Básicamente se han usado para insectos caminadores (o poco voladores) y generalmente sólo se puede medir la respuesta de atracción o repelencia, aunque en el caso de hormigas y larvas de Lepidoptera fue usado para evaluar el seguimiento de una feromona de ruta. La mayor ventaja de estos olfatómetros es que su construcción es muy simple. Las desventajas de este tipo de aparatos han sido claramente señaladas por Hare (1998) e incluye, entre otras, problemas de interpretación de los resultados, y problemas de saturación del estímulo dentro del olfatómetro cuando se usan compuestos muy volátiles.
Olfatómetros con aire
En este tipo de aparatos la idea es usar aire para transportar las moléculas odoríferas; pueden ser divididos en aquéllos de una sola elección, doble elección y los de múltiple elección, usualmente de cuatro vías. Típicamente este tipo de aparatos están constituidos por el olfatómetro, un flujómetro para controlar el flujo de aire, filtros con algún adsorbente (p. ej. carbón activado) para limpiar de impurezas el aire introducido al olfatómetro, un sistema de humidificación y una bomba de aire/vacío. El olfatómetro puede hacerse en alguna compañía que trabaje vidrio bajo el diseño del investigador, pero también existen compañías que venden comercialmente dichos aparatos. Estos tipos de aparatos han sido usados para evaluar la respuesta de insectos caminadores (hormigas, chinches, larvas de lepidópteros) e insectos de limitada capacidad de vuelo (picudos) y voladores de tamaño pequeño (parasitoides, microlepidópteros). Han sido utilizados en la búsqueda de feromonas sexuales, de agregación, de ruta y en respuesta a volátiles vegetales.
Doble elección
El modelo más utilizado de un olfatómetro de doble elección es el de tipo tubo “Y”, aunque también hay modelos en “T”. Generalmente este tipo de aparatos se construye de vidrio pero también de cartón y plástico. El tamaño puede variar de acuerdo con el tamaño del insecto a estudiar. El funcionamiento básico es que el olor es pasado a través de un brazo de la “Y” y aire limpio a través del otro, así la proporción de insectos entrando o alejándose del brazo que contiene el olor es usada como una medida de la atracción o repelencia del extracto o compuesto evaluado (McIndoo, 1926). Las desventajas que presentan son su bajo poder de resolución y la difícil interpretación de los resultados (Hare, 1998).
Múltiple elección
Túnel de vuelo. Debido a que las respuestas de los insectos realizadas en el aire son altamente integradas, los bioensayos que utilizan aire con insectos voladores son probablemente los más discriminantes en la investigación de feromonas (Baker & Linn, 1984). Así, el túnel de vuelo ha sido utilizado principalmente para bioensayos en la identificación de feromonas y kairomonas en insectos voladores, aunque también ha sido empleado para insectos caminadores. El túnel de vuelo puede ser construido por el investigador o adquirido comercialmente (Figura 4). Estos aparatos pueden hacerse de diversos materiales que no despidan olores que afecten la respuesta de los insectos. Los materiales más usados son vidrio o acrílico transparente. El vidrio tiene la ventaja de que puede ser limpiado fácilmente usando algún disolvente. Sin embargo, su fragilidad es un punto en contra, y en la construcción de túneles grandes (> 2 m), es preferible usar acrílico. Por otra parte, el acrílico es menos frágil, pero se debe tener cuidado con el disolvente usado para limpiarlo ya que puede reaccionar con éste.
Olfatómetro de cuatro vías. Este tipo tiene varias ventajas con respecto al olfatómetro tipo “Y” (Hare, 1998). Por ejemplo, tiene cuatro cámaras, lo que permite evaluar más de un compuesto o diferentes concentraciones de un compuesto al mismo tiempo. También minimiza la turbulencia que comúnmente se presenta en las uniones del tubo “y”, la cual eventualmente mezcla los olores ofrecidos. En este tipo de olfatómetro se crean cuatro campos distintos de olor dentro de una cámara en donde los individuos pueden moverse libremente. Esta libertad de movimiento es importante para que el insecto pueda explorar los diferentes campos de olor ofrecidos. Las compañías de EUA (ARS) y Alemania (Syntech) generalmente lo fabrican en acrílico transparente.
Figura 4. Túnel de viento para determinar la actividad biológica (Tomada de Baker & Linn 1984).
Servoesfera (compensador de locomoción)
Este tipo de aparato permite registrar la trayectoria de un insecto en respuesta a una fuente de olor. El primer prototipo de una servoesfera fue construida en el Instituto Max Planck de Alemania (Kramer, 1976). El insecto modelo es mantenido sobre un globo de acrílico, al cual se le envía un flujo de aire con el extracto o compuesto a evaluar. Los desplazamientos de la esfera causados por el movimiento del insecto son monitoreados por generadores de pulso permitiendo la reconstrucción de la trayectoria del insecto. Pueden ser evaluados varios parámetros usando este tipo de aparato, incluyendo la velocidad lineal y angular, la duración y dirección del desplazamiento (McMahon et al., 2001). Un modelo comercial de este tipo de aparato ha sido desarrollado por Syntech, el cual involucra un programa de computadora para activar el sistema. La respuesta de varios insectos y otros artrópodos a feromonas sexuales y de agregación, y a volátiles de plantas y vertebrados, se han estudiado usando la servoesfera.
Condiciones para la realización de los bioensayos
El número de individuos a evaluar por cada tratamiento y si estos serán observados individualmente o en grupos son aspectos importantes que deberán ser considerados antes de iniciar los bioensayos. Generalmente, lo deseable es evaluar a los insectos individualmente de manera que el comportamiento del individuo no afecte la respuesta de otros individuos. Por ejemplo, es posible que un insecto al caminar deposite compuestos químicos sobre las paredes del olfatómetro que puedan afectar el comportamiento de su conespecífico. El número de repeticiones es trascendental en cuanto a la fortaleza de las conclusiones alcanzadas en cualquier estudio, y dependerá de factores tales como la disponibilidad de material biológico, el tipo de olfatómetro utilizado y el modelo a estudiar. Por ejemplo, el número de repeticiones varía en los estudios de la identificación de feromonas sexuales usadas por machos durante la búsqueda de pareja y de kairomonas usadas por las hembras durante la búsqueda de hospedera en Lepidoptera. Siempre se requieren un menor número de repeticiones durante la identificación de feromonas, esto posiblemente se debe a que, en general, las respuestas de los machos a este tipo de feromonas es alto (> 90%), mientras que la respuesta a las kairomonas es bajo (< 50%). La hora del día apropiada para realizar las observaciones es un aspecto práctico en cualquier estudio (Martin & Bateson, 1993). Es bien conocido que las actividades de los insectos, al igual que otros animales, presentan un ritmo circadiano, así, por ejemplo, una hembra de palomilla que libera feromona durante la noche, puede hacerlo al inicio, a la mitad o al final de la noche, dependiendo de la especie; mientras que en otra parte de la noche, usualmente durante las primeras horas, oviposita sobre su planta hospedera. Si nosotros estamos interesados en estudiar la respuesta de machos a la feromona sexual, entonces debemos observar a los machos durante el periodo de llamado. Por el contrario, si deseamos estudiar la respuesta de hembras a volátiles vegetales que éstas usan como una señal durante la búsqueda de hospedera, debemos observar a los insectos durante la parte del día en que las hembras ovipositan. Así, para determinar el momento más adecuado para la observación debemos realizar una extensa búsqueda de literatura para saber si existe información acerca de la hora del día que determinada especie de insecto realiza la conducta de interés. Si dicha información no está disponible para la especie a estudiar, se recomienda realizar observaciones preliminares que permitan establecer el periodo más adecuado de observación. En algunas ocasiones, al estudiar insectos de hábitos nocturnos, es conveniente mantener los insectos en condiciones de fotoperiodo invertido (p. ej. luz en la noche, oscuridad durante el día), de manera que las observaciones puedan realizarse durante las horas de trabajo. El tiempo de observación es un parámetro que habrá que definir con anterioridad y con observaciones preliminares o a través de una búsqueda de literatura.
Registro del comportamiento
Los registros pueden detallar solamente la frecuencia y el tiempo de ocurrencia del comportamiento de interés, o bien incluir información adicional, tales como la fecha y hora del experimento, la edad, sexo, estado sexual del insecto observado, así como otras variables ambientales (temperatura, humedad relativa y condiciones de iluminación).
Existen diferentes maneras de registrar el comportamiento de los insectos durante el bioensayo. La forma seleccionada dependerá de los objetivos del estudio. Indudablemente una de las formas más sencillas para registrar las frecuencias de los actos comportamentales observados es usando papel y lápiz. La ventaja de esta forma de registro es el ahorro del tiempo para el análisis de la información, pero puede ser limitada si el comportamiento de los insectos estudiados es muy rápido, de manera que no permita escribir y observar. Otra limitante consiste en que el menor descuido del observador puede resultar en la potencial pérdida de eventos importantes. Si uno está interesado en conocer la duración de los parámetros estudiados debe de disponer de un cronómetro. Una alternativa al uso de papel y lápiz, sobre todo cuando la respuesta de los insectos es muy rápida, es el uso de una grabadora para registrar la conducta. Posteriormente, la información puede ser vaciada a un formato previamente diseñado y desde ahí analizada. Este último punto puede ser una de las desventajas de usar una grabadora ya que tomará mayor tiempo que el de usar sólo papel y lápiz.
El registro a mano usando una computadora personal representa un punto intermedio entre el registro usando papel y lápiz, y un sistema de video, el cual permite al experimentador estudiar la conducta de los insectos con más detalle, pero requiere equipo costoso. Martin & Bateson (1993) discuten las ventajas y desventajas de usar una computadora personal para registrar la conducta. El software para el diseño de experimentos, colección, y análisis de la información puede ser desarrollado por el investigador asociado con un programador, o bien adquirirlo de una compañía comercial. En este último caso tenemos a OLFA (http://www.exetersoftware.com/index.html), que es un programa para colectar y analizar datos comportamentales obtenidos con olfatómetros de cuatro vías. Los datos obtenidos con este programa incluyen el tiempo que un insecto pasa en las diferentes áreas del olfatómetro, el número de ingresos a cada área, el área en el cual el insecto entró primero, los actos observados. Un segundo programa comercial es “The Observer XT” (http://www.noldus.com/), que es un software desarrollado para colectar, analizar y manejar datos comportamentales de insectos. Existen varias versiones de este sistema una de las cuales permite combinar el software con la tecnología de video y multimedia. Este software ha sido bastante utilizado para estudiar el comportamiento de diversas especies de insectos. Por ejemplo, Rojas et al. (2000) usaron este programa para registrar los actos involucrados en el comportamiento de oviposición de la palomilla de la col sobre diferentes plantas hospederas.
Las técnicas de análisis de imagen han sido ampliamente usadas para la adquisición y análisis de datos comportamentales (Wratten, 1993). El uso del video ha sido ampliamente utilizado para estudiar el mecanismo de orientación de insectos a feromonas sexuales (Willis & Baker, 1994; Justus et al., 2002) y a volátiles de plantas hospederas (Zanen & Cardé, 1996). También se ha usado en estudios de locomoción, por ejemplo, el video fue usado para registrar el trayecto de caminado de una hembra de Trichogramma maidis en la localización de huésped de diferentes razas. Además, puede ser usado para estudiar otros aspectos de la conducta de los insectos, por ejemplo, el número de visitas de un insecto a una cierta área para observaciones finas de la postura del cuerpo durante el comportamiento sexual, durante la inspección de un posible hospedero, o en respuesta a la presencia de una presa (Varley et al., 1993). El sistema básico para el análisis de imagen consiste en una cámara de video, las de circuito cerrado son las mejores, ya que son pequeñas, livianas y muy sensitivas. Sin embargo, la tecnología de las videocámaras ha progresado lo suficiente para conseguir equipos que reúnen muchas características de las cámaras de circuito cerrado y son una excelente opción para filmar la conducta de los insectos. Hay varios experimentos de los cuales se puede ser obtener suficiente información sobre la conducta de los insectos, por ejemplo, el simple registro en dos dimensiones de su trayectoria de vuelo (Riley, 1993; Young et al., 1993). Muchos de los estudios para investigar los mecanismos de orientación de los machos hacia las feromonas sexuales en palomillas han sido registrados con una sola cámara. En estos registros, los machos parecen moverse de izquierda a derecha y viceversa (p. ej. de manera zigzagueante). Sin embargo, algunos investigadores han observado que los machos suben y bajan suavemente en el espacio y así su vuelo tiene componentes verticales y horizontales (El-Sayed et al., 2000). En este último caso es necesario usar dos cámaras para registrar el vuelo de los insectos en tres dimensiones. Varios sistemas de video han sido descritos (Riley et al., 1990; Mankin & Hagstrum, 1995; Hardie & Young, 1997) para registrar el vuelo de un insecto en tres dimensiones. En estos estudios, el vuelo de los insectos fue registrado desde dos proyecciones usando dos videocámaras conectadas a una videograbadora. Los otros componentes del sistema comprenden una videograbadora y un monitor de TV. El principal requerimiento de la videograbadora es que produzca imágenes de alta calidad en modo de pausa y tener un buen control para atrasar y adelantar la cinta de video. Se recomienda usar cables coaxiales para hacer las conexiones entre los diferentes componentes del sistema para reducir la interferencia. Otros aspectos importantes que deben considerarse a fin de obtener imágenes de calidad incluyen la posición de la cámara, la iluminación y que el fondo de la arena sea lo más homogéneo posible (Young et al., 1993; varley et al., 1993).
El hecho de usar una videograbadora para registrar el comportamiento de insectos tiene varias desventajas. En primer lugar, el almacenamiento análogo en una videograbadora sufre de una resolución fijada impuesta por el estándar de grabación (Becerra et al., 1993). En segundo lugar, el análisis de las cintas es una actividad que requiere de mucho tiempo. En tercer lugar, no es posible la inspección directa de los trayectos durante el curso de los experimentos. Debido a lo anterior, se han desarrollado sistemas capaces de registrar el vuelo y locomoción de insectos en respuesta a semioquímicos en tiempo real (p. ej. El-Sayed et al., 2000; Balch et al., 2001). En muchos casos los sistemas han sido construidos para uso personal (El-Sayed et al., 2000, biotracking, http://www.kinetrack.org), aunque en algunos casos el software es de dominio publico (p.ej. Wintrack, http://www.dpwolfer.ch/wintrack/) o puede ser adquirido de alguna compañía especializada (p.ej. Ethovision XT, http://www.noldus.com/). La elección del software dependerá de varios factores, además del económico, que se puedan registrar los insectos en olfatómetros grandes, que puedan ser usados con diferentes especies de insectos, que midan la posición y velocidad de los insectos, que maximicen el uso de equipo existente, que minimicen el análisis de los datos y que sea fácil de usar.
Análisis electrofisiológico
Electroantenograma (EAG)
El EAG fue desarrollado por Schneider (1957) como un bioensayo para determinar la actividad de las fracciones separadas durante la identificación de la feromona sexual del gusano de seda, Bombyx mori. El EAG es la suma de potenciales de los receptores olfativos presentes a lo largo de la antena registrada simultáneamente por un electrodo localizado en el epitelio sensorial. El EAG registra la diferencia de potencial entre el electrodo de registro (colocado en la parte distal de la antena) y el electrodo indiferente colocado en la base de la antena. En otras palabras, cuando se tiene una antena conectada entre dos electrodos y se hace una estimulación con un compuesto biológicamente relevante al insecto en estudio, los receptores emiten una respuesta eléctrica llamada pico electroantenográfico, que es una despolarización de la membrana. De cada pico de EAG, la variable principal que se mide es la amplitud del pico, aunque también se puede medir el tiempo de recuperación. La técnica de EAG ha sido muy utilizada en estudios sobre la identificación por aproximación de feromonas de insectos, mediante la determinación de la respuesta EAG a compuestos de diferente longitud de la cadena del tentativo compuesto feromonal, y tomando en cuenta la isometría geométrica (Z o E) de la molécula. La EAG también se ha usado en estudios de dosis-respuesta y en ensayos de compuestos inhibidores de la respuesta antenal a estímulos de feromona (Roelofs, 1984).
Los primeros equipos de EAG fueron hechos en forma casera y consistían de dos electrodos hechos de hilo de plata/cloruro de plata, un amplificador de alta impedancia (1012 ohm) y un osciloscopio que permitía registrar la despolarización de la línea base (Roelofs, 1984). Sin embargo, actualmente el equipo básico de EAG está disponible comercialmente (Syntech), y consiste en una tarjeta inteligente de adquisición de datos para uso en una computadora personal, una caja de conexión de señales y una zonda en donde se colocan los electrodos, además de un par de manipuladores y un microscopio (Figura 5). La tarjeta contiene un convertidor digital-analógico de 16 bits, un amplificador, un procesador digital de señales, memoria buffer y un control lógico programable. La tarjeta acondiciona la señal, la amplifica, la digitaliza, la filtra y la transfiere a la computadora. La sonda contiene un preamplificador. Actualmente existen dos modelos de sonda, la primera, llamada universal, contiene soportes para electrodos de vidrio o electrodos de tungsteno; el segundo modelo de sonda usa soportes que permiten conectar la antena con un gel conductor, de este modelo existen una versión que permite conectar hasta cuatro antenas simultáneamente. Los electrodos de vidrio se llenan con una solución salina (p. ej. cloruro de sodio 7.5 g, cloruro cálcico 0.21 g, cloruro de potasio 0.35 g, y bicarbonato de sodio 0.2 g disueltos en 1 L de agua) para hacer la conexión entre la antena y el hilo de plata que transfiere la señal a la sonda. Con este sistema y el software necesario se pueden analizar muestras para EAG y cromatografía de gases acoplada a un electroantenodetector (CG-EAD), constituyéndose en una poderosa herramienta en el análisis de feromonas y de atrayentes. En el caso de CG-EAD, la tarjeta puede manejar además de la señal del EAG, señales de baja frecuencia como las señales del electrómetro del CG, y puede procesar las dos señales simultáneamente. A la fecha esta clase de equipo ha sido usado exitosamente en muchos laboratorios de ecología química alrededor del mundo, contribuyendo fuertemente a la identificación de nuevas feromona y kairomonas de insectos.
Figura 5. Esquema de la técnica electroantenografia (EAG) (Tomada de Syntech).
Registro unicelular
Los primeros registros de células sensoriales fueron obtenidos del sensulo tricoideo de las antenas de escarabajos y palomillas (Schneider et al., 1964). Posteriormente, se reportó la técnica de registro extracelular que consiste en conectar el electrodo de registro a la punta del sénsulo y el electrodo indiferente a la base de la antena (Kaissling, 1974). Esta técnica permite medir la actividad y la excitación o inhibición de una neurona olfativa a un compuesto. Cuando varias neuronas olfativas están localizadas en un mismo sénsulo, pueden ser discriminadas por su potencial de acción (espiga), forma y amplitud. La técnica de registro unicelular es más complicada que la técnica de EAG. Actualmente el equipo para hacer registros unicelulares puede ser adquirido de Syntech, y usa un sistema de adquisición de datos inteligentes (IDAC-4) similar al descrito para el equipo de EAG, sólo que la señal emitida por la neurona olfativa es amplificada × 1000 veces. El convertidor A/D y los circuitos de control para el IDAC-4 están contenidos en una caja de 19 pulgadas, la cual es conectada a la computadora vía un cable USB. Además, por lo general el equipo cuenta con un par de bocinas para escuchar el sonido de las señales (espigas eléctricas) emitidas por las células receptoras cuando son estimuladas. Esta respuesta es comparada con el número de señales emitidas por el sénsulo al ser estimulada por aire. Los resultados de registros de células sensoriales se pueden mostrar de dos formas, una de manera directa enseñando el gráfico obtenido ante cada estímulo y comparado contra el del aire. La segunda opción es tomando en cuenta que en esta técnica, generalmente el tiempo de estimulación es de 20 segundos, y con la ayuda de un software especializado se puede determinar el número de espigas emitidas por sénsulo por segundo para un estímulo determinado y compararlo contra el número emitido al aire. Las células sensoriales son conectadas por medio de microelectrodos de tungsteno o usando microelectrodos de vidrio llenos con una solución salina. La composición de la solución salina parece ser más importante en los registros de unicelulares que en los de EAG. La principal ventaja de los microelectrodos de tungsteno es que las conexiones son fácilmente logradas con sénsulos que están densamente empaquetados o son muy pequeños, mientras que la principal ventaja de los microelectrodos de vidrio es que se pueden lograr registros de bajo ruido debido a la baja impedancia eléctrica creada entre la hemolinfa y la solución salina (Bjostad, 1998).
Cromatografía de gases acoplada a un electroantenodetector (CG-EAD)
Un avance notable en la identificación de feromonas y atrayentes de insectos ocurrió cuando se acopló el EAG a un cromatógrafo de gases (CG), funcionando el EAG como un segundo detector, llamado detector antenal. El primer registro de CG-EAD fue reportado por Moorhouse et al. (1969) con el lepidóptero Diparopis castanea. Quienes evaluaron el extracto de la feromona sexual producida por hembras con antena de machos. Sin embargo, y a pesar de que la resolución de los picos cromatográficos no fue buena debido a que en aquellos años la CG utilizaba columnas empacadas, los autores encontraron que las antenas de los machos respondieron consistentemente a tres picos del extracto de las hembras. En este trabajo se sentaron las bases para el desarrollo posterior de la técnica y fue Arn et al. (1975) quienes reportaron un CG-EAD usando una columna capilar en cuyo extremo final se acopló un conector de vidrio en forma de T. Con la ayuda de este dispositivo, una parte de la muestra inyectada y separada pasa directamente al detector de ionización de flama (DIF) del CG usando una línea de transferencia (columna capilar de vidrio sin fase) y la otra parte al EAG (en una relación 1:1). Para evitar problemas de condensación de la fracción de muestra que va en la línea de transferencia al EAG, fue calentada a 200 ºC, y para evitar que la muestra llegue caliente a la preparación antenal, se incorporó un flujo de aire humidificado justo antes de que la muestra llegue a la antena. Con la ayuda del GC-EAD, Arn et al. (1975) confirmaron que el (E, Z)-7,9-acetato de dodecadienilo era un componente importante de la feromona sexual de Lobesia botrana, plaga importante de uvas en los países mediterráneos.
El sistema de calentamiento para evitar la condensación del efluente está disponible comercialmente (Altech Associates, Supelco, EUA, y Syntech, Alemania). Igualmente existen conectores vendidos por una compañía Australiana (SGE Analytical Science) para separar la muestra que va al DIF y al EAG. El primer tipo de conector (variable outlet Splitter,) es de acero inoxidable y tiene una separación ajustable de 5:1 a 1:1000 a una temperatura de 300 ºC. Este conector tiene la ventaja de incorporar un segundo “make-up” para incrementar el flujo y reducir el volumen muerto (el “make-up” uno se incorpora directamente al DIF). Sin embargo, este conector tiene el inconveniente de ser bastante caro y su mantenimiento se debe hacer cuidadosamente ya que este dispositivo consiste de una pequeña aguja de acero inoxidable que se abre o se cierra, dependiendo de la relación que se quiera tener DIF: EAD. Una alternativa es utilizar un conector (Fixed Outlet Splitter) con una tasa de separación fija de 1:1, 1:5, o 1:10 al detector 1:detector 2. Este separador se coloca dentro del horno del CG, tiene la ventaja de no requerir el segundo “make-up”, ya que funciona solamente con el gas de arrastre, por lo tanto, el análisis de muestras usando este conector es más económico. Este dispositivo consiste en un par de tuercas (una macho y otra hembra), cuyo interior contiene una férula de grafito que tiene en un extremo un pequeño agujero por donde se conecta la parte final de la columna capilar y en el otro extremo de la férula tiene dos agujeros en donde se insertan las líneas de transferencia, una para el DIF y la otra para el EAD.
La gran ventaja de la CG-EAD es que discrimina selectivamente aquellos picos del extracto que no tienen actividad antenal y sugiere compuestos candidatos a ser evaluados en pruebas comportamentales y de campo. La CG-EAD ha demostrado ser una herramienta invaluable en la identificación de feromonas y atrayentes de insectos de diferentes órdenes. Sin duda alguna que la CG-EAD es la técnica más utilizada en la identificación de semioquímicos comparada con los métodos tradicionales. Por ejemplo, en una revisión de los artículos publicados en el Journal of Chemical Ecology sobre la identificación de feromonas y atrayentes de insectos en los últimos años (2000-2005), de un total de 1167 artículos publicados, se encontró que el 55% reportaron haber utilizado CG-EAD, siendo lepidópteros y coleópteros los más estudiados. En nuestro laboratorio hemos desarrollado la CG-EAD que ha sido de gran utilidad en la identificación de la feromona sexual de Copitarsia decolora (Rojas et al., 2006), la feromona de agregación del picudo del agave, Scyphophorus acupuctatus (Ruiz-Montiel et al., 2008) y en la búsqueda de posibles atrayentes para moscas de la fruta a partir de volátiles aislados de frutos de hospederas (Malo et al., 2005; Cruz-López et al., 2006).
Después de determinar los picos con actividad antenal, el paso siguiente consiste en la identificación química de esos picos por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM). Sin embargo, hemos observado que el tiempo de retención de los picos obtenidos por GC-EAD es ligeramente mayor que los de GC-MS, esto debido a que GC-EAD trabaja a alta presión por el flujo de los gases que utiliza, y el CG-EM opera a alto vacío, por lo que no es fácil acoplar ambos equipos. En este sentido, Weisbecker et al. (2004) reportaron el primer equipo CG-EAD-EM, que permite determinar los picos con actividad antenal y simultáneamente identificarlos por CG-EM. Los autores identificaron los compuestos volátiles de la papa que fueron antenalmente activos al escarabajo de la papa, Leptinotarsa decemlineata.
Cromatografía de gases-Registro unicelular (CG-RUC)
En algunas ocasiones la técnica CG-EAD no permite ver la respuesta antenal a los compuestos de un determinado extracto debido a que existen pocos receptores en la antena del insecto y entonces la CG-RUC se convierte en un suplemento de la CGEAD. El primer acoplamiento de CG y RuC fue logrado independientemente por Wadhams (1982) trabajando con el descortezador Scolytus scolytus, y por Van Der Pers & Lofstedt (1983) trabajando con la palomilla Agrotis segetum. En esta técnica el efluente de la columna del CG es detectado simultáneamente por el DIF del CG y la neurona olfativa del insecto. El uso de CG-RUC ha permitido determinar los receptores de la feromona y volátiles de hospedera y de no-hospedera (Tømmerás & Mustaparta, 1987; Wibe et al., 1997; Bichao et al., 2005). Por ejemplo, en el escarabajo descortezador Ips typographus, la respuesta a los olores de la corteza fue estudiada por CG acoplada a registros electrofisiológicos de células receptoras olfativas, y se encontraron cuatro fracciones menores pertenecientes a dos extractos que excitaban células receptoras olfativas. La respuesta de las células fue dividida en dos grupos principales reaccionando exclusivamente a una fracción, sugiriendo que las células fueron altamente especializadas a un olor de la hospedera particular. Sin embargo, un extracto efectivo o fracción no pudo ser encontrada para la mitad de las unidades olfatorias respondiendo a la corteza natural, sugiriendo que posiblemente los compuestos activos relevantes fueron perdidos durante la extracción y/o CG (Tømmerás & Mustaparta, 1987). En este mismo sentido, Bichao et al. (2005) estudiaron las neuronas receptoras de la antena del picudo Anthonomus rubi a compuestos producidos por la planta de fresa usando CG acoplada a registro unicelular. Reportaron la presencia de cinco tipos de neuronas receptoras olfativas, identificadas de acuerdo con un olor primario, por ejemplo, el compuesto al cual las neuronas son más sensitivas. Los compuestos identificados fueron (-)-germacrene d, (-)-ß-cariofileno, salicilato de metilo, (E)-ß-ocimeno y (3E)-4,8-dimethil-1,3,7-nonatrieno, que están presentes en la planta de fresa, y fueron producidos en grandes cantidades cuando los picudos estaban alimentándose.
Identificación química
Cromatografía de gases
La CG es una de las técnicas más utilizadas en el análisis de compuestos volátiles con una fuerte aplicación en la industria petroquímica, farmacéutica, plástico, pinturas, agroquímicos y de alimentos, entre otras. El uso de la CG en la separación y aislamiento de semioquímicos de insectos se remota a los años 60. Las ventajas de la CG para el análisis de compuestos volátiles y semivolátiles son: 1) tiene alta resolución, ya que más de 100 compuestos pueden ser separados en una sola corrida; 2) la CG es simple, rápida, flexible, robusta, y relativamente es un método barato que puede ser usado rutinariamente con un mínimo de entrenamiento; 3) el detector DIF, es bastante sensitivo (10-100 picogramos) y universal, permitiendo la detección de todos los compuestos de una extracto; 4) los índices de retención (tiempo de retención relativos) son reproducibles entre diferentes instrumentos y laboratorios, constituyéndose en una valiosa herramienta para la identificación de compuestos; y 5) un equipo de CG puede trabajar por décadas (Heath & dueben, 1998).
Los componentes básicos de la CG son: un cilindro conteniendo el gas de arrastre y su regulador de flujo. El horno que es donde se encuentra la columna, considerada el corazón del equipo, ya que en la columna es donde ocurre la separación de los componentes de la muestra. En un extremo la columna se conecta al inyector, que es una pequeña cámara que permite la entrada de la muestra a la columna. El otro extremo de la columna se conecta al detector, que es un sistema que convierte la señal química obtenida en el análisis en señal eléctrica. Esta señal eléctrica puede ser plasmada en un registrador o en un integrador. Los equipos modernos incorporan una computadora desde la cual se controla el funcionamiento del aparato, análisis, y edición y se imprime o se guarda la información del análisis.
El gas de arrastre funciona como fase móvil y contribuye al desplazamiento de los componentes de la muestra a través de la columna hacia el detector. La selección del gas de arrastre es un punto importante ya que no deberá ser reactivo, no-tóxico, no-flamable, y en la medida de lo posible no debe ser caro. Los gases más comúnmente utilizados son hidrógeno, helio y nitrógeno. El nitrógeno a flujo lento, permite obtener una buena eficiencia cromatográfica. Sin embargo, la eficiencia del nitrógeno decrece cuando se incrementa o disminuye el flujo, y esto origina prolongados tiempos de permanencia en el inyector y en la columna, con la posibilidad de causar degradación térmica a algún componente de la muestra. Estos factores contribuyen a que el nitrógeno sea calificado como no apropiado como gas acarreador, a pesar de su bajo costo. El hidrógeno no es caro y tiene excelentes propiedades cromatográficas, sin embargo, la mayor desventaja es su alta flamabilidad, haciendo indispensable que el flujo del “split” y de purga sean expulsados hacia fuera del laboratorio. El helio representa una buena opción, ya que aunque es más caro que los otros gases, no es explosivo y proporciona una buena resolución cromatográfica. Debido a que el helio es completamente inerte, no hay posibilidad de reacción con el analito.
El inyector es una pequeña cámara en donde se volatiliza la muestra líquida disuelta en un disolvente para ser arrastrada hacia la columna. Existen varios tipos de inyectores: “on-column”, “split”, “splitless”, y cada uno tiene sus ventajas y desventajas. En el caso de muestras de estudios de semioquímicos, por lo general se utiliza el inyector en “splitless”, ya que éste permite la entrada de la muestra en su totalidad, a diferencia del inyector en “split” que sólo permite la entrada de la muestra en un porcentaje determinado dependiendo del flujo de venteo con el que se esté trabajando.
Uno de los componentes principales de la CG es la columna y es considerado el corazón del proceso del GC debido a que en la columna ocurre la separación de los componentes presentes en una muestra inyectada. Las columnas capilares comerciales normalmente son tubos de sílica fundida cubiertos externamente con poliamida, conteniendo por dentro la capa de la fase estacionaria. Las columnas empacadas están hechas de vidrio o de metal y por lo general son de 1-3 m de longitud por 2-6 mm diámetro interno. Sin embargo, el uso de este tipo de columnas en ecología química es limitado debido a la baja resolución comparado contra las columnas capilares. Las columnas capilares de 20-30 m largo por 0.25-0.32 mm de diámetro interno son las más comunes para trabajar en CG con buena resolución y tiempos razonables de análisis. Columnas de menor longitud reducen la eficiencia pero pueden ser muy útiles para hacer un análisis preliminar. Por el contrario, columnas de 100 m de largo han sido usadas en aquellos casos en donde se requiere una alta resolución o en el análisis de mezclas complejas. Columnas de más 100 m de largo no son prácticas ya que se eleva mucho la presión dentro de la columna, además de que los tiempos de retención son muy grandes, disminuyendo la eficiencia de la columna. La selección de la fase estacionaria de la columna adecuada depende de las propiedades físicas y químicas del analito a ser separado. Hay dos factores por considerar, primeramente la volatilidad de los compuestos que determinará en términos generales los parámetros como temperatura, grosor de la fase estacionaria requerida para el análisis. En segundo lugar hay que considerar la interacción de los analitos con la fase estacionaria que determinará la separación de los compuestos con volatilidad similar. En este sentido, se sugiere que los compuestos polares pueden resolverse mejor en columnas conteniendo fase estacionaria intermedia o polares. En algunas ocasiones cuando se analizan muestras nuevas que contienen compuestos similares como isómeros se sugiere que el análisis de las muestras se realice en al menos dos columnas diferentes para minimizar la posibilidad de elusión coincidente. Sin embargo, hay casos en donde los compuestos coeluyen y la separación puede ser un problema, como en isómeros E y Z, y en isómeros de cadena larga con la presencia de doble enlace. En este caso, para separar isómeros E de Z se sugiere utilizar una columna de 50-60 m de largo. Los compuestos monoinsaturados pueden ser pobremente resueltos o separados de sus respectivos análogos saturados en columnas conteniendo fase estacionaria no polar, aunque estos compuestos pueden ser separados fácilmente en columnas con fase polar. En términos generales, las columnas con fase no polar tienen ventaja sobre las columnas con fase polar. Hay varias compañías que venden columnas capilares con diferentes fases para ser utilizadas en CG en el análisis de compuestos. Para la selección de la columna, hay que tomar en cuenta los siguientes puntos. Primero, que cada fase estacionaria tiene un máximo y un mínimo de temperatura de trabajo; segundo, la fase no polar es menos susceptible al daño por aire y agua que la fase polar y por lo tanto tienen mas tiempo de vida. La generación de sitios activos en columnas con fase polar puede ser problemático en el análisis de trazas en los que pequeñas cantidades del analito polar dan picos con una pobre o mala resolución, o desapareciendo por completo los picos, dando resultados falsos. Tercero, las columnas con fase no polar muestran mayor eficiencia que las columnas con fase polar, dando picos afinados con una buena forma. Esta ventaja puede hacer la diferencia en aquéllos casos de separaciones difíciles. En ecología química es frecuente que el análisis deberá hacerse en ambas columnas capilares con fase polar y no polar y determinar el índice de Kovats o de retención en ambas columnas en el caso de aquellos compuestos que no están comercialmente disponibles. Otro punto frecuentemente encontrado en ecología química se refiere a la separación de compuestos quirales, que no es posible separarlos con columnas capilares conteniendo la fase estacionaria tradicional, de manera que es necesario utilizar una columna capilar conteniendo una fase quiral (β y γ-ciclodextrina) (Leal et al., 1995). Sin embargo, hay hidrocarburos alifáticos quirales que son difíciles de separar debido a la falta de un grupo funcional para ser derivatizado para formar diastereoisómeros (Meierhenrich et al., 2003), aunque recientemente los estereoisómeros del 7,11-dimetilheptadecano fueron separados usando una columna capilar conteniendo una fase de ciclodextrina modificada (Chow et al., 2004), abriendo la posibilidad para caracterizar feromonas constituidas por hidrocarburos ramificados. Otro componente importante de la CG son los detectores, existen varios tipos de detectores. Sin embargo, los detectores más utilizados en ecología química son el DIF y el detector de espectrometría de masas (EM), teniendo este último buena sensibilidad, del orden de los picogramos.
Hay algunos factores que afectan la buena separación de los picos CG como la volatilidad de los analitos, volatilidad del disolvente, la concentración, diámetro de la columna, el grosor de la fase estacionaria y la temperatura inicial de la columna. El proceso de inyección de la muestra deberá minimizar la pérdida por descomposición o por absorción. En este punto es crucial le selección del disolvente, ya que el volumen de vapor generado durante la inyección de un volumen dado de diferentes disolventes no es el mismo, pero es dependiente del peso molecular y de la densidad del disolvente. Además, ese volumen generado es dependiente de la presión de cabeza de la columna, que depende del diámetro y la longitud de la columna y del gas de arrastre usado. En ese sentido, disolventes densos de bajo peso molecular como el agua y el metanol, crean grandes volúmenes de vapor. Otros factores que deben ser considerados son la compatibilidad del disolvente con el detector, el punto de ebullición del disolvente y la compatibilidad del disolvente con la fase estacionaria de la columna.
Cromatografía de gases-espectrometría de masas
Sin lugar a dudas la CG acoplada a espectrometría de masas (EM) es la técnica más usada en la identificación de semioquímicos, esta técnica combina las características de la CG con la EM para identificar compuestos presentes en una muestra. Para aquéllos interesados en conocer más sobre espectrometría de masas, pueden consultar McLafferty & Turecek (1993). El uso de un espectrómetro de masas como un detector de un cromatógrafo de gases fue desarrollado en 1950 por Roland Gohlke & Fred McLafferty. El espectrómetro de masas más comúnmente asociado a un cromatógrafo de gases es el llamado cuadropolo o detector selectivo de masas. Otro analizador bastante utilizado es de la trampa de iones. Otros analizadores menos usados, principalmente por sus altos costos, son el de sector magnético y el de tiempo de vuelo. En general, la técnica consiste en separar los compuestos por medio de la CG y conforme son separados, enviados al espectrómetro de masas, en donde los compuestos son ionizados mediante impacto de electrones y fragmentados. Los iones son separados en función de la relación masa/carga y la abundancia relativa de cada ion es registrada como el espectro de masas. Otra alternativa de ionización en fase gaseosa es mediante la ionización química, con este procedimiento es posible obtener el ion molecular que proporciona el peso molecular de un compuesto determinado.
El patrón de fragmentación de un compuesto se ajusta a un patrón similar correspondiente al grupo que pertenece y ésta es la información básica para la identificación de un compuesto. En la actualidad los nuevos equipos de GC-MS incluyen una base de datos (NIST) que contiene más de 200,000 espectros de masas del mismo número de compuestos. El espectro de masas obtenido de un compuesto determinado es comparado contra los compuestos de la base de datos y de esta manera la base de datos sugiere una identificación tentativa que deberá ser confirmada. Las identificaciones tentativas son confirmadas por comparación de los datos espectrales y de los tiempos de retención con aquéllos de estándares auténticos. En los casos en donde no se cuenta con los estándares, se calcula el índice de Kovats para cada compuesto y de esta forma se aproxima uno a la identificación. Otra posibilidad de confirmar la identificación cuando se cuenta con el sintético consiste en una co-inyección de una cantidad determinada del compuesto conocido y si es el compuesto es el correspondiente, entonces el área del pico en la muestra será mayor.
Otras técnicas de espectrometría de masas
La espectrometría de masas por reacción de transferencia de protones (PTR-MS por sus siglas en inglés) es otra técnica que se ha usado para la identificación de compuestos volátiles de plantas. La principal diferencia del espectrómetro de masas convencional es que el PTR-MS usa ionización química “suave” de las moléculas de los volátiles por reacción con iones de hidronio (H3O+) producidos por un origen externo de iones (Tholl et al., 2006). El espectrómetro de masas que usa un analizador cuadropolo está disponible comercialmente por Analytk GmbH, Austria. Este equipo permite la detección de los volátiles rápidamente con un bajo límite de detección (10-100 pptv). Recientemente también se ha desarrollado un espectrómetro de masas con un analizador de tiempo de vuelo por reacción de transferencia de protones (PRT-TOF por sus siglas en inglés) que permite la detección de volátiles de plantas en tiempo real (Brilli et al. 2011). El uso del analizador de tiempo de vuelo permite la detección completa e instantánea del espectro de masas total con un tiempo de resolución de menos de un segundo.
En algunos casos cuando los componentes de un semioquímico no son volátiles se ha usado espectrometría de masas por bombardeo rápido de átomos (FAB-MS por sus siglas en inglés). Por ejemplo, usando esta técnica, extractos conteniendo la feromona disuasiva de oviposición de Rhagoletis cerasi L. Fueron disueltos en una matriz líquida de tioglicerol y bombardeada con átomos de Xenón, obteniéndose el espectro de masas de una molécula que fue identificada como un derivado de taurina con dos centros quirales (Hurter et al., 1987).
Otras técnicas analíticas espectrales
Espectroscopia de infrarrojo (IR). Ésta es una técnica analítica que permite identificar los grupos funcionales presentes en una molécula. La región del infrarrojo en el espectro electromagnético comprende desde el rojo en el espectro visible hasta la región de las microondas entre 10 y 12,800 cm-1. Sin embargo, las aplicaciones analíticas relacionadas con la identificación de los grupos funcionales de los compuestos se encuentran en la región media del infrarrojo desde 670 a 4000 cm-1. La IR se fundamenta en que las moléculas tienen frecuencias a las cuales rotan y vibran, y estos movimientos tienen niveles de energía discretos. En el espectro de infrarrojo, la radiación incidente es absorbida cuando la energía de la radiación incidente coincide con la energía requerida para excitar un particular modo vibracional. La multiplicidad de vibraciones que ocurre simultáneamente produce un complejo espectro de absorción que es característico de grupos funcionales presentes en la molécula y de las configuraciones de los átomos. Por esto, el espectro de infrarrojo de un compuesto orgánico es considerado como la “huella digital”. Además, mediante la interpretación de la información proporcionada por el IR es posible determinar la presencia o ausencia de grupos funcionales específicos. Para el análisis por IR, la muestra es colocada en un micro disco de bromuro de potasio o disuelta en tetracloruro de carbono y colocado en una celda. La celda o el disco se colocan en un condensador por donde pasa el rayo de IR. Es importante que se elimine el disolvente para que la banda de absorción de éste no interfiera con la muestra. Posteriormente surgió la Transformada de Fourier, incorporándose al IR y convirtiéndose en FTIR lo que permitió obtener espectros más finos y con una menor cantidad de muestra. Años más tarde se combinó con la cromatografía de gases-infrarrojo con transformada de Fourier (GC-FTIR). En cuanto al uso de esta técnica a la identificación de feromonas, mediante GC-FTIR ha sido posible la identificación de feromonas de Lepidoptera (leal et al., 2006) y de Hymenoptera (Krokos et al., 2001), trabajando con pequeñas cantidades de muestra.
Resonancia Magnética Nuclear
La RMN es una técnica instrumental que ha contribuido enormemente a la determinación estructural de nuevos compuestos en los últimos años debido a los grandes avances logrados en aspectos como el incremento en la potencia del campo magnético, la inclusión de la transformada de Fourier, y otras mejoras logradas a través de nuevos experimentos. La RMN es una técnica que permite determinar la estructura completa de un compuesto y con los equipos modernos la cantidad de muestra que se requiere es del orden de nanogramos. Mediante experimentos de 1H RMN se puede determinar el número y tipo de protones presentes en una molécula y por 13C RMN el número y tipo de carbonos presentes en la molécula, de manera que con esta información se puede armar el rompecabezas. La muestra deberá ser preparada con mucho cuidado tratando de que sea pura y disuelta en cloroformo deuterado, y colocada en tubos de RMN. Los primeros aparatos de RMN tenían una potencia de 60 MHz y los experimentos eran conducidos en modo de onda continua. Con el surgimiento de los electromagnetos los aparatos de 1H RMN pudieron registrar espectros a 100 MHz. Casi al mismo tiempo surgió la introducción de la computadora conectada al espectrómetro y permitió un nuevo método de adquisición y procesamientos de los datos de RMN, lo que es conocida como la transformada de Fourier (TF) (Williams & King 1990). La incorporación de la TF permitió registrar 13C NMR espectros de muestras diluidas. Además, permitió los experimentos bidimensionales o de correlación. Con el tiempo los electromagnetos se volvieron imprácticos, posteriormente surgieron los magnetos superconductores permitiendo disponer de equipos de RMN que operan hasta 800 MHz con computadoras veloces que permiten hacer el análisis en muy corto tiempo y con pequeñas cantidades de muestra. En la identificación de feromonas de insectos hay varios ejemplos en donde ha sido necesario apoyarse en el análisis de RMN para elucidar la estructura correcta, por ejemplo, el espectro de uno de los componentes de la feromona de reconocimiento de la reina de Solenopsis invicta Buren fue obtenido con 0.9 μg de muestra utilizando un espectrotrómetro Nicolet de 300 MHz, para lo cual la muestra fue colectada por CG y transferida a un pequeño tubo capilar (Rocca et al., 1983) resultando ser (E)-6-(1-pentenil)-2H-2-piranona.
Síntesis de feromonas
En ecología química la síntesis de los semioquímicos es un paso transcendental que permite confirmar la identificación del compuesto, al cual se le tendrá que confirmar la actividad biológica mediante pruebas en bioensayos y en campo. En la preparación de cualquier compuesto hay varios puntos a considerar, por ejemplo, la longitud de la cadena, la presencia de dobles enlaces y posible formación de isómeros geométricos y los grupos funcionales presentes. Sin embargo, la preparación de cada compuesto es un procedimiento único y permite diseñar nuevas rutas de síntesis. En el caso de feromonas de insectos de lepidopteros es fuerte la presencia de compuestos como alcoholes, aldehídos y acetatos de 12, 14 y 16 carbonos, aunque podremos encontrar moléculas de hasta 18 y 20 carbonos y otros tipos de moléculas. Hay varios trabajos que han abordado la síntesis de feromonas como por ejemplo, Henrick (1977), y Mori (1989) sobre síntesis de feromonas quirales. Algunas síntesis de feromonas han sido trabajos que han llevado muchos años de investigación buscando la forma correcta de preparar la feromona con la actividad correcta, por ejemplo, la síntesis de la feromona de la escama, Aspidiotus nerii (Petschen et al., 1999). En Latinoamérica, los investigadores brasileños han contribuido a la síntesis de feromonas de insectos con resultados sobresalientes (Ferreira & Zarbin, 1996; Baraldi et al., 2002), toda vez que esta parte es una actividad de vital importancia en la identificación de semioquímicos de insectos.
Conclusiones
Los nuevos avances surgidos en las técnicas de colecta de volátiles, análisis e identificación semioquímicos han contribuido sin duda a que este proceso se haga en menos tiempo y de manera más eficiente contando para ello con procedimientos de síntesis más eficaces. Algunas técnicas como las electrofisiológicas han permitido tener un mejor conocimiento del proceso de percepción por parte de los insectos, y esto permitirá diseñar en el futuro mejores estrategias de control de plagas.
Agradecimientos
Al Dr. Leopoldo Cruz López por sus comentarios a una versión inicial de este manuscrito.
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