Читать книгу Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología - Myriam Consuelo López Páez - Страница 20

El propósito de este aparte es sugerir diferentes metodologías, basadas en fundamentos distintos para realizar el diagnóstico de toxocariasis.

Ensayo inmunoenzimático

La técnica de ensayo inmunoenzemático (ELISA, por su sigla en inglés) permite determinar la concentración del antígeno o del anticuerpo mediante el uso de uno de ellos en fase sólida y el otro en solución; el complejo antígeno-anticuerpo se detecta a través de una enzima que reacciona con su sustrato. Las enzimas más utilizadas son fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa oxidasa y beta-D-galactosidasa. La reacción enzimática se detiene en la fase lineal de la curva con la incorporación de ácidos o bases fuertes, según el tipo de sustrato. La cantidad de producto formado en la reacción se mide en un espectofotómetro, al leer la densidad óptica a la longitud de onda, en la cual el color generado tiene su máxima absorción (17-23).

En Colombia, esta técnica se usa con mayor frecuencia para la búsqueda de anticuerpos. En este caso, el antígeno se fija a la fase sólida y luego se agrega la muestra en la que se sospecha que se encuentra el anticuerpo específico. A continuación, se agrega otro anticuerpo dirigido contra el anticuerpo específico de interés; este segundo anticuerpo está unido o conjugado a la enzima. Finalmente, el sustrato de la enzima se incorpora en la placa, con lo que se produce una reacción colorimétrica que se cuantifica con espectrofotómetro. Durante el proceso de estandarización de la prueba de ELISA, se establece el punto de corte que sirve de referencia para determinar si la muestra analizada es positiva o negativa (17-23).

Obtención de parásitos adultos de Toxocara canis y embrionación de los huevos

La obtención de parásitos adultos y la embrionación de los huevos de Toxocara canis son un procedimiento importante en la producción del antígeno secretor/ excretor usado en la técnica ELISA para la detección de anticuerpos (23). Para la obtención de los adultos de T. canis, se sugiere elegir alguna de las siguientes opciones y llevarla a cabo:

1. Entrar en contacto con centros veterinarios que realicen diagnóstico parasitológico y puedan proporcionar los especímenes una vez los caninos hayan sido sometidos a tratamiento antihelmíntico.

2. Entrar en contacto con centros de zoonosis, a fin de que proporcionen los parasitos adultos de T. canis postratamiento o por procedimientos de necropsia.

3. Infectar caninos experimentalmente con huevos de T. canis bajo condiciones de bioterio y obtener los adultos por procedimientos estandarizados y reglamentados en los protocolos de bioética y bienestar animal establecidos en la normatividad nacional e internacional.

Todos estos procedimientos deben ser realizados por profesionales debida mente capacitados y certificados.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: jeringas de 5 ml con su respectiva agua, equipo de disección —es decir, tijeras, pinzas, cuerda o sedade cirugía, etc.–, gasa, papel craft, toallas absorbentes desechables, bolsas para disposición de desechos biológicos, cajas de Petri, guantes quirúrgicos, tapabocas, estereoscopio, jabón antiséptico, microscopio, centrífuga, fiolas de 125 ml, baño serológico a 28 °C, incubadora a 37 °C, termómetro, vasos de precipitado, Tranquilan®, solución de eutanasia (ver anexo 7) y pepsina ácida (ver anexo 8).

Procedimiento

1. Una vez obtenidos los parásitos adultos, colocarlos en solución salina al 0.85 % en un vaso de precipitado.

2. Luego de colectar todos los parásitos, lavarlos con agua corriente varias veces para dejarlos libres de desechos.

3. Colocar los parásitos de nuevo en solución salina al 0.85 % y seleccionar las hembras con ayuda del estereoscopio. Las hembras se caracterizan por ser de mayor longitud y presentar el extremo posterior romo; los machos son más cortos y el extremo posterior termina en una espícula que les confiere una forma puntiaguda.

4. Desechar los machos en bolsas para disposición de desechos biológicos y extraer los úteros grávidos de las hembras. Para ello, asegurar cada hembra con una pinza, cortar ambos extremos del parásito y, con ayuda de otra pinza, hacer presión a lo largo del cuerpo hasta extraer el contenido completo. Depositar los úteros en una solución de pepsina ácida al 1 %.

5. Dejar el material obtenido en agitación magnética a 37 °C por 2 horas.

6. Realizar tres lavados con agua destilada en tubos de centrífuga (aproximadamente 1:10) durante 5 minutos a 100 g.

7. Preparar una solución de formalina al 1 % en fiolas de 125 ml.

8. Mezclar 50 ml de esta solución y 1 ml (aproximadamente) del sedimento obtenido.

9. Dejar las fiolas en incubación a 28 °C por 28 días en presencia de luz (día y noche) y con agitación ligera (cada 24 horas). La embrionación debe controlarse de manera microscópica a partir del día 20; cuando el 80 % de los huevos esté embrionado, la muestra estará lista para ser administrada a animales o para continuar con el procedimiento de obtención de larvas y del antígeno secretorio/excretorio.

Descortezamiento de los huevos y obtención de larvas II de Toxocara canis Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: vasos de precipitado, probetas, balanza, agitador magnético, incubadora a 37 °C, microscopio, portaobjetos, cubreobjetos, guantes, tubos plásticos para centrífuga, solución descortezadora (ver anexo 9), solución equilibrada de Hanks (ver anexo 10), medio de cultivo de larvas de Toxocara canis, pipetas automáticas y puntas, papel indicador de pH y campana de CO2.

Materiales y reactivos estériles

Los materiales y reactivos estériles necesarios para este método son: fiolas, frascos, probetas, gasas, tubos de tapa rosca, medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle (DME, por su sigla en inglés) (ver anexo 11), microscopio invertido y pipetas Pasteur.

Procedimiento

1. Lavar los huevos de Toxocara canis con solución salina al 0.85 % tres veces durante 3 minutos a 500 g. Repetir los tres lavados con agua desionizada.

2. Medir la cantidad de sedimento remanente (±5 ml).

3. Preparar la solución descortezadora.

4. Colocar la suspensión obtenida en agitación suave a 37 °C por 2 horas. Revisar el proceso al microscopio cada 30 minutos.

5. Centrifugar para eliminar la solución descortezadora.

6. Lavar con agua destilada estéril de 5 a 10 veces, centrifugando a 800 g por 5 minutos. Realizar el último lavado con solución equilibrada de Hanks en centrífuga refrigerada a 850 g.

7. Recolectar el sedimento en un tubo, realizar el recuento y hacer los cálculos respectivos:

Ejemplo:

2 ml→160 larvas

X→10 000 larvas

X = 125 ml de solución equilibrada de Hanks. Adicionar 200 ml

de solución equilibrada de Hanks para compensar las pérdidas.

10 000 larvas → Aproximadamente 5 ml de medio DME.

8.Agregar 200 larvas por tubo. Teniendo en cuenta las pérdidas, pueden obtenerse 17 tubos y 2 controles de medio.

9.Incubar los tubos a 37 °C en atmósfera de CO2 al 10 % y de medio de DME.

Preparación del medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle para mantenimiento de larvas II de Toxocara canis

1. Preparar 1000 ml de medio con H2O destilada estéril.

2. Retirar una alícuota de 100 ml con NaHCO3 y medir el pH.

3. La solución de bicarbonato es una solución volátil y es estable por 1 mes si se guarda en condiciones apropiadas (tubos de tapa rosca a 4 °C; pH 7.0±0.2).

4. Adicionar penicilina (1000 UI/ml) y estreptomicina (250 mg/ml).

5. Mantener el medio restante en refrigeración.

6. Servir 5 ml de medio en cada tubo tapa rosca.

7. Agregar las larvas a cada tubo (10 000):200, dejando 2 tubos como controles.

8. Incubar a 37 °C en atmósfera de CO2 al 10 %.

9. Verificar cada 3 días la movilidad de las larvas agitando el medio y observando en el microscopio invertido. Recoger el sobrenadante (3 ml aproximadamente) cada 7 días.

10. Agitar de nuevo el día previo a la obtención del antígeno excretorio/secretorio.

11. Reponer el volumen con medio DME fresco (3 ml).

Diagnóstico serológico para detección de anticuerpos tipo IgG anti Toxocara canis mediante ensayo inmunoenzimático

A continuación, se presentan las condiciones experimentales necesarias para llevar a cabo el diagnóstico serológico para la detección de anticuerpos tipo IgG anti-Toxocara canis.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: placas de poliestireno 96 pozos Immulon I, papel secante, nevera, cronómetro, micropipetas automáticas y puntas, frasco lavador, solución reguladora de revestimiento 0.05 M pH 9.6 (ver anexo 12), solución reguladora de fosfato (PBS, por su sigla en inglés) 0.15 M pH 7.4 (10X) (ver anexo 13), PBS 0.15 M pH 7.4 más Tween 20 (PBS-T20) (ver anexo 14), solución reguladora de dietanolamina pH 9.8 (ver anexo 15), paranitrofenilfosfato e hidróxido de sodio 3N (ver anexo 16).

Condiciones de trabajo utilizadas en Colombia Antígeno secretorio/excretorio

Preparar a partir de cultivos de larvas de Toxocara canis en medio DME (ver anexo 11). La concentración de trabajo estandarizada para ELISA es de 2.5 µg/ml de antígeno.

Suero

La dilución estandarizada de suero es de 1:800, es decir, una parte de suero por 800 partes de solución de trabajo PBS más Tween 20 (PBS-T20) (ver anexo 14). Las muestras problema y los sueros controles positivo y negativo se preparan a esta dilución.

Conjugado (anticuerpo secundario)

La solución de trabajo del conjugado corresponde a anti-IgG humana marcada con fosfatasa alcalina en una dilución de 1:1500, es decir, una parte de conjugado por 1500 partes de solución de trabajo PBS-T20 (ver anexo 14).

Sustrato

El sustrato utilizado es una solución de paranitrofenilfosfato diluido en dietanolamina pH 9.8 (ver anexo 15) en una proporción 1:1 w/v (1 mg de paranitrofenilfosfato diluido en 1 ml de solución reguladora de dietanolamina). La reacción se detiene con NaOH 3N (ver anexo 16).

Punto de corte

Valores de absorbancia mayores o iguales a 0.4 son considerados positivos; valores de absorbancia menores que 0.4 se consideran negativos.

Procedimiento

En la figura 1.2, se esquematiza el procedimiento ELISA indirecto para la detección de anticuerpos tipo IgG anti-Toxocara canis.

Figura 1.2. Procedimiento para la realización de la prueba de ELISA indirecto.

Fuente: cortesía de Olga Lucía Morales Reyes.

1. Agregar 100 µl de la solución reguladora de revestimiento en cada pozo con el antígeno secretorio/excretorio de Toxocara canis.

2. Incubar las microplacas en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 3 horas.

3. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

4. Agregar 100 µl de las diluciones de los sueros problema. Las muestras se sirven por triplicado. Dejar seis pozos de la placa libres de suero; estos pozos se utilizan como control de antígeno (tres de ellos) y control de conjugado (los tres restantes). Los seis pozos de control se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 2 horas.

5. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

6. Agregar 100 µl de la dilución del conjugado en cada pozo, excepto en los tres pozos que sirven como control de antígeno; estos pozos se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a 4 °C durante 18 horas.

7. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

8. Agregar 100 µl de la solución de sustrato en cada uno de los pozos.

9. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos y detener la reacción añadiendo 25 µl de NaOH 3N a cada pozo.

10. Leer la absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Confrontar las lecturas obtenidas con el valor de punto de corte establecido, revisar los resultados del control positivo y negativo y hacer el reporte correspondiente.

Los resultados se reportan como reactivo (RE) o no reactivo (NR), colocando en todos los casos el valor numérico de la absorbancia. El formato de reporte de resultados debe incluir un párrafo de interpretación que especifique el punto de corte de la técnica. Los valores de absorbancia iguales o mayores que 0.4 se consideran positivos, mientras que valores de absorbancia menores que 0.4 son negativos.