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Wie bei der Entwicklung und Optimierung einer konventionellen HPLC-Methode auch, stellt sich bei LC-MS-Methoden eingangs die Frage nach dem Ziel, das die Trennmethode mit MS-Detektion verfolgt. Je nach Anzahl der vorhandenen Probenbestandteile und der Güte der analytischen Information steht eine LC-MS-Trennung wie jede andere LC-Trennung auch in dem Spannungsfeld zwischen möglichst viel analytischer Information und möglichst kurzer Analysenzeit, oder anders ausgedrückt: so viel analytische Information wie nötig in so kurzer Analysenzeit wie möglich. Schnelle Trennungen gehen dabei mit einem gewissen Verlust an analytischer Information in Form von Auflösung einher. Leicht einsichtig wird dies, wenn man sich die Peakkapazität – bei Gradienttrennungen definiert als der Quotient aus der Gradientzeit und der durchschnittlichen Peakbasispeakbreite – relativ zum Gradientvolumen [3] als Produkt aus Gradientdauer und Flussrate betrachtet.

Abbildung 3.1 veranschaulicht anhand eines UHPLC-Anwendungsbeispiels, wie sich die Peakkapazität in Abhängigkeit des Gradientvolumens, hier der einfacheren Übertragbarkeit wegen ausgedrückt als das Vielfache des Säulenvolumens, ändert. Es ergibt sich, dass die Peakkapazität einer Gradienttrennung mit steigendem Gradientvolumen zunächst steil ansteigt und dann einer Sättigung entgegenstrebt. Gemäß dem sich daraus ableitenden Gradientvolumenkonzept sind schnelle Trennungen, die durch kleine Gradientvolumina auf kleinlumigen und kurzen Säulen erreicht werden, damit begrenzt in ihrer Trennleistung und eignen sich daher bevorzugt für Screening-Experimente. Zusätzlichen Nutzen bietet hier das Massenspektrometer als weitere Trenndimension, indem es auch potenziell koeluierende Substanzen noch hinreichend voneinander getrennt zu detektieren und – mit gewissen Einschränkungen – zu quantifizieren vermag. Eine vollständige Basislinientrennung ist somit bei der MS-Detektion je nach verwendetem Massenspektrometer zur Quantifizierung nicht so unbedingt erforderlich wie in der konventionellen HPLC. Möglichst hohe Peakkapazitäten erfordern größere Gradientvolumina, längere Säulen und damit längere Laufzeiten.

Letzteres ist apparativ mit der Massenspektrometrie gut zu bewältigen. Bei schnellen Screening-Trennungen hingegen wirken zwei Einschränkungen: Erstens können sich zu viele koeluierende Substanzen während ihrer Ionisierung in der Ionenquelle gegenseitig behindern (Konkurrenzionisation) und damit das quantitative Resultat verfälschen. Zweitens benötigt nahezu jedes Massenspektrometer für jedes einzelne zu messende Masse-zu-Ladungsverhältnis eine gewisse Zeitspanne (Cycle Time), die die Datenrate begrenzt. Schnelle UHPLC-Trennungen überfordern bis heute noch viele Massenspektrometer mit ihrer Geschwindigkeit: Peakbreiten von 5 s und darunter können je nach Gerät zu gering sein, um alle gewünschten Massensignale so rasch abzutasten, dass die für eine statistisch belastbare Quantifizierung gewünschte Anzahl von 25 Datenpunkten pro Peak oder mehr tatsächlich erzeugt werden kann. In den meisten Fällen begnügt man sich zur Quantifizierung daher bereits mit rund 10 Datenpunkten. Nichtsdestotrotz kann es bei der Methodenentwicklung nötig sein, weniger effiziente Trennungen (d. h. breitere Peaks) und mehr Auflösung durch Selektivität zu erzeugen als die Chromatographie prinzipiell zuließe, damit die Massenspektrometrie bei der Datenerzeugung Schritt halten kann. Ein Fall aus der Praxis sind Quantifizierungen in komplexen Proben mittels Tripel-Quadrupol-Massenspektrometern, die die erforderliche Selektivität der Detektion mit Tandem-MS im SRM-Modus bereitstellen. Je mehr SRM-Übergänge, gegebenenfalls für überlappende Substanzzonen, das Massenspektrometer abarbeiten muss, umso größer wird die Cycle Time und entsprechend geringer die Datenrate. Ein Ausbremsen der Chromatographie kann je nach MS-Typ und Gerätegeneration das quantitative Ergebnis messbar verbessern.

Abb. 3.1 Peakkapazität in Abhängigkeit des Gradientvolumens, ausgedrückt als Vielfaches des Trennsäulenvolumens, gemessen für eine 250 × 2,1 mm-Säule mit einer Packungsteilchengröße von d_p = 2,2 μm bei F = 670 μL/min.