Читать книгу Métodos analíticos de microbiología general y aplicada - Jorge Luna Fontalvo - Страница 19

II. Medios de cultivos

Introducción

En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas muy variadas y diferentes. La Microbiología se ha podido desarrollar debido a la posibilidad de estudiar especies aisladas de microorganismos, gracias a la aplicación de los medios de cultivos.

Existen y se utilizan una gran variedad de medios de cultivos cuya composición varía de acuerdo con las necesidades nutricionales de los organismos que se pretende estudiar. Así, el trabajo de aislamiento en cultivo puro de una especie dada puede facilitarse con ayuda de medios de cultivos que aprovechan alguna característica particular para sus exigencias nutricionales, aparte de considerar otros requerimientos como la temperatura, el oxígeno, el pH, etc. (Gómez y Batista, 2006).

Los medios de cultivos se definen como cualquier preparado, sólido o líquido, que contiene todas las sustancias nutritivas para el desarrollo de los microorganismos. Este debe ser estéril, tener un pH adecuado y estar protegido de la contaminación ambiental (Valenzuela, 2007).

En general, todo medio de cultivo debe contener los siguientes grupos de nutrientes:

•Fuente de hidrógeno: constituye la fuente de energía. Generalmente, es un azúcar que funciona a la vez como carbono.

•Aceptores de hidrógeno: son indispensables para aquellos microorganismos que no ocupan el oxígeno en la respiración y para aquellos microorganismos fermentadores que no utilizan sus propios metabolitos como aceptor de hidrógenos.

•Fuente de carbono: todos los microorganismos necesitan una fuente de carbono; algunos utilizan el CO2 del aire (autótrofos), pero la mayoría de las bacterias utiliza compuestos orgánicos carbonados preformados (organótrofos).

•Fuente de nitrógeno: es esencial para todos los organismos. Algunos lo requieren como compuesto orgánico, y otros pueden utilizar compuestos inorgánicos. Un pequeño grupo puede utilizar el nitrógeno atmosférico; por ejemplo, Azotobacter.

•Sales minerales: aportan elementos tales como azufre, fósforo y algunos activadores enzimáticos presentes en las coenzimas de los citocromos y en las peroxidasas (oligoelementos: Ca2+, Mg2+, Fe2+, Co2+, Mn2+, Cu2+, etc.). Todos los microorganismos necesitan aporte de sales minerales para su desarrollo.

•Factores de crecimientos: un factor de crecimiento es un compuesto orgánico (aminoácidos y bases nitrogenadas) que una célula debe tener para su crecimiento pero que ella misma no es capaz de sintetizar.

Clasificación de los medios de cultivos

Los medios de cultivos se han clasificado en forma artificial de acuerdo con su estado físico, composición química y utilización, solo para fines de ordenamientos.

Según su estado físico, los medios se clasifican en:

•Medios líquidos: comúnmente llamados caldos. Se emplean para la homogenización de muestras, realizar diluciones y enriquecimiento del medio de cultivo. Así mismo, son útiles para la activación de cepas microbianas liofilizadas. Por lo general, estos medios suelen servirse en tubos de ensayos o en matraces cuando se requiere analizar grandes cantidades de muestras (figura 7). Ejemplos: caldo peptona, caldo infusión cerebro corazón, caldo lactosado, caldo brila, etcétera.

Figura 7. Medios de cultivos líquidos. a)Caldo lactosado, b) Caldo brila, c) Caldo Salmosyst.

•Medios sólidos: se conocen como agares. Se obtienen a partir de medios de cultivos líquidos a los cuales se les agrega una sustancia solidificante, como por ejemplo agar-agar, gelatina o gel de sílice (los agares no deben confundirse con el agar-agar; este último es solo un agente solidificante y no brinda condiciones nutricionales). Los agares son empleados frecuentemente en placas de Petri o en tubos de ensayos de manera inclinada (figura 8), y son útiles para el aislamiento de microorganismos a través del desarrollo de colonias y mantenimiento de cultivos puros. Ejemplo: agar peptona, agar SPC, agar EMB, agar SS, agar sal manitol rojo de fenol, etcétera.

Figura 8. Medios de cultivos sólidos. a) Agar SS, b) Agar Baird Parker, c) Agar sangre, d) Agares LIA, TSI y citrato en forma inclinada.

•Medios semisólidos: tienen una consistencia sólida leve o gelatinosa. Provienen de medios de cultivos líquidos a los cuales se les ha adicionado una pequeña cantidad de agar-agar (0,4-0,8%). Por lo general, se usan tubos de ensayo y se emplean para determinar la movilidad de bacterias (figura 9). Ejemplo: agar SIM, agar MIO, etcétera.

Figura 9. Medios de cultivos semisólidos agar SIM. a) Observación de crecimiento bacteriano en todo el medio (móvil), b) Observación de crecimiento bacteriano solo en la línea de inoculación (inmóvil).

Fuente: Benadof (2008).

Según la composición química, los medios se clasifican en:

•Medios sintéticos o artificiales: se preparan a partir de ingredientes químicamente definidos, conociéndose exactamente su calidad y cantidad, y se utilizan en estudios de metabolismo. Ejemplo: agar nutritivo, agar TCBS, agar XLD, etcétera.

•Medios naturales: se desconoce su composición exacta. Se preparan a partir de hidrolizados, extractos de células o tejidos (ejemplo: extracto de carne, extracto de levadura, peptona, etc.). Son de uso común en los laboratorios de rutina y también se pueden adquirir como productos comerciales, deshidratados, elaborados por laboratorios. Ejemplo: agar peptona, agar sangre, agar papa dextrosa, agar zanahoria, etcétera.

Según la utilización, los medios se clasifican en:

•Medios comunes o básicos: son aquellos en los cuales crecen gran número de especies bacterianas poco exigentes nutricionalmente. Ejemplo: caldo común, agar peptona.

•Medios enriquecidos: son medios de cultivos comunes a los que se les agregan ciertos ingredientes que enriquecen su condición nutritiva original. Se emplean para el aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes o injuriados. Ejemplo: agar sangre, que está constituido de agar peptona más 5% de sangre desfibrinada; el caldo glucosado, que es caldo de peptona enriquecido con 1% de glucosa.

•Medios selectivos: son aquellos medios que han sido formulados químicamente de tal forma que favorecen el crecimiento de la especie que se desea aislar y al mismo tiempo suprimen el de cualquier otra especie competidora. Se preparan incluyendo generalmente algunas sustancias inhibidoras como antibióticos, sales biliares, etc. Ejemplos: agar SS, agar EMB (que al mismo tiempo son medios diferenciales).

•Medios diferenciales: son aquellos que favorecen el aislamiento de una especie dada a partir de un cultivo mixto, permitiendo reconocerla o detectarla a través de una característica bioquímica de valor taxonómico que le es propia: por ejemplo, la hemólisis de glóbulos rojos (en agar sangre), la coagulación del plasma, la fermentación de azúcares a través de cambios de pH que se detectan en el medio (que contienen un indicador de pH adecuado, como azul de bromotimol, rojo fenol, etcétera).

Las entidades comerciales de medios de cultivos como Merck, Oxoid, BBL, Difco, Scharlau, 3M, entre otras, han logrado desarrollar una variedad de medios de cultivos, facilitando el estudio de los microorganismos cultivables desde sus características nutricionales, fisiológicas, bioquímicas, serológicas y moleculares.

Objetivo

Conocer la clasificación, preparación, esterilización y utilización de los medios de cultivo.

Materiales

•Agar nutritivo deshidratado.

•Agar EMB deshidratado.

•Caldo nutritivo deshidratado.

•Matraces Erlenmeyer de 250 mL.

•Tubos de ensayo de 18 x 150 mm.

•Agua destilada.

•Placas de Petri estériles.

•Algodón y gasa.

•Espátula.

•Vidrios de reloj.

•Fósforos o encendedor.

•Mecheros.

•Cabina de flujo laminar.

•Autoclave.

•Baño de María.

•Balanza.

Procedimiento

—­Pese las cantidades exactas para preparar 50 mL de caldo nutritivo y 100 mL de agar nutritivo.

—Disuelva las cantidades pesadas en el volumen correspondiente de agua destilada utilizando los matraces Erlenmeyer. El caldo nutritivo se disuelve fácilmente sin necesidad de calentar, mientras que para disolver el agar nutritivo será necesario calentar a baño de María por algún tiempo. El matraz deberá taparse con algodón y gasa para evitar evaporación y agitarse de vez en cuando para que la disolución sea uniforme. El medio estará disuelto cuando ya no haya formación de grumos y se observe transparente y no turbio.

—Dispense el caldo nutritivo en cantidades de 5 mL en tubos de ensayo y tápelos.

—Esterilice los medios de cultivo en autoclave a 15 lb de presión (121 °C) por quince minutos.

—Una vez esterilizados los medios, deje enfriar a temperatura ambiente los tubos que contienen caldo.

—Deje enfriar el agar contenido en el matraz a unos 45 °C (hasta tolerar en la palma de la mano) y en condiciones asépticas (cabina de flujo laminar). Distribúyalo en las cajas Petri estériles (15-20 mL en cada una).

—Una vez solidificados los medios, guarde los tubos y cajas en el refrigerador ya que serán empleados posteriormente, rotulándolos de forma adecuada.

Preguntas complementarias

1.¿Por qué se recomienda enfriar a 45 °C el agar antes de efectuar el vaciado en las cajas Petri?

2.¿Qué son medios de cultivos cromogénicos y fluorogénicos?

3.¿Qué ventajas tienen los medios de cultivos Petrifilm? Cite al menos tres ejemplos.

4.¿Cuál es la diferencia entre un medio de cultivo selectivo y un medio de cultivo electivo?