Читать книгу Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología - Myriam Consuelo López Páez - Страница 26

A continuación, se describen las técnicas utilizadas para la identificación del complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii, las cuales incluyen el examen con azul de metileno amortiguado y las coloraciones especiales.

Examen con azul de metileno amortiguado

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: portaobjetos, cubreobjetos, tubo de ensayo, aplicador, solución amortiguadora de acetato (ver anexo 17) y azul de metileno amortiguado (ver anexo 18) (7,31,32).

Procedimiento

1. Tomar una pequeña cantidad de materia fecal con un aplicador y llevarla a un tubo de ensayo.

2. Mezclar con una pequeña cantidad de azul de metileno amortiguado.

3. Incubar a 37 °C durante 15 minutos.

4. Hacer el montaje en un portaobjetos y colocarle un cubreobjetos.

5. Examinar la preparación en 10X y 40X.

A través de esta técnica, es posible observar las características morfológicas del núcleo de los trofozoítos. Esta característica y otros aspectos morfológicos enumerados en la tabla 1.2 facilitan la diferenciación de los trofozoítos de los macrófagos, los cuales también suelen estar presentes en la muestra y son un factor de confusión frecuente.

Tabla 1.2. Cuadro comparativo de las características de los trofozoítos y los macrófagos de

Coloraciones especiales

Las coloraciones especiales descritas a continuación incluyen la tinción con hematoxilina férrica y la tinción tricrómica.

Tinción de hematoxilina férrica

Esta técnica permite detallar la morfología del núcleo, el cariosoma, la membrana y la distribución de la cromatina, los cuerpos cromatoides y las vacuolas (35,36) como se puede observar en la tabla 1.3.

Tabla 1.3. Comparación de la morfología del complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii y otras amibas intestinales.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tubo de cultivo de amibas o materia fecal, gasa, vasos desechables, tubos, centrífuga, agua destilada, papel secante, aplicadores, portaobjetos, soporte metálico, cubreobjetos, recipientes rectangulares con tapa, guantes desechables, tapabocas, fijador de Schaudinn (ver anexo 19), fijador de alcohol polivinílico (PVA, por su sigla en inglés) (ver anexo 20), etanol al 30 %, 50 %, 70 %, 85 % y 90 % (ver anexo 21), solución de albúmina (ver anexo 22), solución saturada de alcohol yodado (ver anexo 23), alumbre férrico (ver anexo 24), hematoxilina al 5 % (ver anexo 25), solución de ácido pícrico (ver anexo 26), xilol y líquido de montaje (citorresin).

Procedimiento

1. Mezclar una parte de heces recién emitidas con tres partes de fijador de Schaudinn o fijador PVA y conservar hasta el momento de la coloración.

2. Filtrar la mezcla anterior con un pedazo de gasa.

3. Centrifugar el filtrado a 800 g durante 10 minutos.

4. Eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento con agua destilada y centrifugar a 400 g durante 10 minutos. Repetir este procedimiento mínimo tres veces o hasta obtener un sobrenadante transparente.

5. Preparar el etanol al 30 %, 50 %, 70 %, 85 % y 95 % a partir de alcohol al 100 %.

6. Preparar la solución saturada de alcohol yodado.

7. Montar los portaobjetos. Escurrir bien el líquido del tubo, colocarlo boca abajo sobre un papel secante durante unos pocos segundos y agregarle varias gotas de solución de albúmina para disolver el sedimento (entre cuatro o cinco gotas).

8. Tomar una gota del preparado y colocarla sobre un portaobjetos. Extenderla horizontalmente con un aplicador hasta obtener una película delgada.

9. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente durante 1 hora.

10. Colocar los portaobjetos horizontalmente sobre un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con alcohol yodado durante 18 horas a temperatura ambiente.

11. Servir los alcoholes al 30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 95 % y 100 % en su respectivo recipiente marcado y tapado.

12. Preparar el alumbre férrico.

13. Pasar los portaobjetos del alcohol yodado a etanol al 50 % durante 3 minutos; luego, a un recipiente con agua destilada durante 3 minutos, y por último, al recipiente con alumbre férrico durante 1 hora.

14. Preparar la hematoxilina al 5 %.

15. Preparar el ácido pícrico.

16. Colocar las placas en un recipiente con agua destilada durante 1 hora.

17. Colocar las placas en la solución de trabajo de hematoxilina al 5 % durante 2 horas. Si la solución de trabajo de la hematoxilina es de buena calidad, las placas tomarán un color morado.

18. Colocar las placas en un recipiente con ácido pícrico durante 1 minuto para decolorar. Tener cuidado de no exceder este tiempo.

19. Colocar las placas en un recipiente y dejarlo bajo el chorro de agua del grifo durante 30 minutos.

20. Pasar las placas por los recipientes con las diferentes concentraciones de alcohol de la siguiente forma: etanol al 30 % durante 15 minutos, etanol al 50 % durante 15 minutos, etanol al 70 % durante 30 minutos, etanol al 85 % durante 15 minutos, etanol al 95 % durante 25 minutos y etanol al 100 % durante 15 minutos.

21. Usar guantes y tapabocas para colocar las placas en xilol en un recipiente tapado adecuadamente. Evitar el contacto directo del xilol con la piel.

22. Sacar uno por uno los portaobjetos del recipiente con xilol y sin dejarlos secar, poner una o dos gotas de citorresin sobre el extremo del extendido. De inmediato, colocar una laminilla, hacer presión y permitir que la solución se difunda. Limpiar los excedentes de los bordes con una gasa antes de dejar secar.

23. Observar al microscopio de luz con objetivos de 10X, 40X y 100X.

Tinción tricrómica

Al igual que la tinción de hematoxilina férrica, la tinción tricrómica permite observar las estructuras morfológicas de quistes y trofozoítos (28,38,39), como se puede ver en la tabla 1.3.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tubo de cultivo de amibas o materia fecal, gasa, vasos desechables, tubos, centrífuga, agua destilada, papel secante, aplicadores, portaobjetos, soporte metálico, cubreobjetos, recipientes rectangulares con tapa, guantes desechables, tapabocas, fijador de Schaudinn (ver anexo 19) o solución fijadora PVA (ver anexo 20), solución de albúmina (ver anexo 22), colorante tricrómico (ver anexo 27), solución saturada de alcohol yodado (ver anexo 23), etanol al 30 %, 50 %, 70 %, 85 % y 90 % (ver anexo 21), alcohol al 90 % acidificado (ver anexo 28), xilol y líquido de montaje (citorresin).

Procedimiento para realizar la tinción tricrómica con fijador de Schaudinn

1. Mezclar una parte de heces recién emitidas con tres partes de fijador de Schaudinn y fijar a 50 °C durante 5 minutos o 1 hora a temperatura ambiente.

2. Filtrar la mezcla anterior con un trozo de gasa.

3. Centrifugar el filtrado a 800 g durante 10 minutos.

4. Eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento con agua destilada y centrifugar a 800 g durante 10 minutos. Repetir este procedimiento mínimo tres veces o hasta obtener un sobrenadante transparente.

5. Montar los portaobjetos. Escurrir bien el líquido del tubo, colocarlo boca abajo sobre un papel secante durante unos pocos segundos y agregar algunas gotas de solución de albúmina con el fin de disolver el sedimento (entre cuatro y cinco gotas, por lo general).

6. Tomar una gota del preparado, colocarla sobre una lámina y extenderla horizontalmente con un aplicador hasta obtener una película delgada.

7. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente durante 1 hora.

8. Colocar los portaobjetos horizontalmente en un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con solución saturada de alcohol yodado durante 1 minuto.

9. Colocar los portaobjetos en alcohol al 70 % durante 1 minuto. Repetir este paso dos veces.

10. Colocar los portaobjetos en el colorante tricrómico de 2 a 8 minutos.

11. Colocar los portaobjetos en alcohol al 90 % acidificado de 10 a 20 segundos o hasta que haya decoloración completa.

12. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % y enjuagar dos veces.

13. Colocar los portaobjetos en xilol durante 1 minuto.

14. Realizar el montaje con bálsamo o cualquier otro líquido de montaje como citorresin.

Procedimiento para realizar la tinción tricrómica con fijador de alcohol polivinílico

1. Mezclar una parte de heces recién emitidas con tres partes del fijador PVA hasta el momento de la coloración.

2. Tomar una gota del preparado, colocarla sobre los portaobjetos y extenderla horizontalmente con un aplicador hasta obtener una película delgada.

3. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente durante 1 hora.

4. Colocar los portaobjetos en sentido horizontal en un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con alcohol yodado durante 10 minutos.

5. Sumergir los portaobjetos en alcohol al 70 % de 3 a 5 minutos y repetir este paso dos veces.

6. Colocar los portaobjetos en el colorante tricrómico de 6 a 8 minutos.

7. Colocar los portaobjetos en alcohol al 90 % acidificado de 10 a 20 segundos o hasta que haya decoloración completa.

8. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % y enjuagar.

9. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % durante 5 minutos.

10. Colocar los portaobjetos en xilol de 5 a 10 minutos.

11. Realizar el montaje con bálsamo o cualquier otro líquido de montaje como citorresin.

Biopsia

El uso de exámenes endoscópicos de colon y recto permite la visualización directa de la lesión sugestiva en caso de cuadro clínico compatible con alguna forma de amibiasis intestinal (7). A su vez, este abordaje posibilita la toma de muestra de tejido de una o más lesiones, con el fin de realizar estudios histopatológicos (8,28,32). Los trofozoítos de E. histolytica se identifican a partir de la coloración del tejido con hematoxilina-eosina, pero en algunas ocasiones se requiere de la tinción tricrómica para diferenciar el trofozoíto de otras células.

Pruebas inmunológicas

Detección de Gal-NAc antilectina

La detección de Gal-Nac antilectina, es una técnica que posibilita la diferenciación entre la especie E. histolytica y la E. dispar a partir de muestras de materia fecal o aspirado de líquido del absceso hepático. En la actualidad, este método solo se encuentra disponible en algunos laboratorios de referencia y no se utiliza como prueba de rutina por sus altos costos (40,41).

Materiales y reactivos

Para este método, se utiliza el kit comercial de Techlab® T5017/30404 (42).

Recolección y manejo de las muestras

La muestra debe ser fresca, recién emitida o almacenada a una temperatura entre 2 °C y 8 °C y la prueba debe llevarse a cabo en las primeras 24 horas luego de la recolección. No deben usarse especímenes fecales recogidos o almacenados en fijadores como formalina al 10 %, solución acética y formol (SAF) o solución fijadora PVA. El congelamiento y descongelamiento de la muestra, sobre todo si se hace más de una vez, puede dar como resultado la pérdida de actividad, debido a la degradación de la adhesina.

Preparación de la muestra

Agregar entre 0.15 g y 0.20 g de materia fecal formada, 400 µl de materia fecal líquida o 400 µl de líquido de absceso hepático a un tubo marcado y añadir 400 µl de diluyente. Finalmente, mezclar en vórtex.

Procedimiento

1. Seleccionar un pozo de la placa de microtitulación como control negativo; otro, como control positivo y otro para la muestra.

2. Transferir 200 µl de la muestra preparada como se explicó antes, a cada uno de los pozos seleccionados para las muestras.

3. Agregar 50 µl del conjugado a todos los pozos.

4. Agregar 50 µl del control positivo al pozo de control positivo.

5. Agregar 100 µl del diluyente al pozo de control negativo.

6. Cubrir los pozos con el adhesivo disponible en el kit.

7. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.

8. Eliminar el contenido de los pozos.

9. Lavar cuatro veces con solución de lavado 1X.

10. Secar sobre papel absorbente.

11. Agregar 100 µl del sustrato a todos los pozos.

12. Mezclar suavemente.

13. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

14. Agregar 50 µl de solución de parada.

15. Mezclar con suavidad.

16. Leer en espectofotómetro a una longitud de onda de 450 nm.

17. Para el cálculo de los resultados, determinar el valor de la absorbancia de los controles positivo y negativo y de las muestras. Restar el valor de absorbancia del control negativo al valor de las muestras. Se considera una muestra positiva si el resultado de la resta de absorbancias es mayor que 0.051.

Pruebas de biología molecular

Reacción en cadena de polimerasa

Al igual que las pruebas para la detección de lectina Gal-NAc para la diferenciación del complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii, la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por su sigla en inglés) es una técnica que solo está disponible en algunos laboratorios de referencia en Colombia y no es utilizada como prueba de rutina para el diagnóstico de la amibiasis (34,43).

Mantenimiento de cultivos (controles positivos, controles negativos y muestras)

Ver mantenimiento de cultivos mixtos y axénicos en los apéndices referentes al cultivo axénico de cepa de referencia HM1:IMSS para E. histolytica (ver anexo 42) y antígeno de E. histolytica.

• Controles positivos para E. histolytica y E. dispar: Los controles positivos utilizados son las cepas de referencia HM1:IMSS para E. histolytica y SAW 760 para E. dispar.

• Control negativo: Como control negativo, se utiliza una cepa de Entamoeba invadens.

• Recuento celular: Realizar tres lavados con solución tampón de fosfatos a 4 °C (PBS 0.02 M, pH 7.4) (ver anexo 29) a 700 g y 4 °C durante 5 minutos y resuspender el sedimento en la misma solución. Llevar a cabo el recuento celular en cámara de Neubauer para calcular la cantidad de ADN esperada luego del proceso de extracción, con la siguiente fórmula:

N.° promedio de trofozoítos/volumen de resuspensión x 10 000 = N.° de trofozoítos/ml

Después del recuento, se realiza una centrifugación con las mismas condiciones utilizadas en los lavados. Luego, el sedimento se congela a -196 °C en nitrógeno líquido y se almacena a -20 °C hasta la extracción del ADN (44).

• Procesamiento de muestras: Para el procesamiento de muestras, primero, es necesario cultivar las muestras de materia fecal positivas por microscopía para el complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii en medio de Robinson para realizar el aislamiento primario (ver anexo 30) (45). Después de 8 días de observación, descartar los aislamientos negativos. Con los aislamientos positivos, realizar repiques sucesivos cada 48 horas como se describe en el aparte sobre mantenimiento de cultivos mixtos. Para finalizar, se hace el recuento celular de la manera antes descrita.

Extracción de ADN mediante lisis no alcalina

El proceso de lisis no alcalina es una modificación de la lisis alcalina, en el cual se prescinde del uso de ditiotreitol (DTT) e hidróxido de sodio (NaOH) en el proceso inicial de la lisis. Esta modificación ha sido descrita en procesos de extracción de ADN de protozoarios intestinales (25,43,46-51,52).

Procedimiento

1. Incorporar Tris-HCl 2M pH 8.3 (ver anexo 31) directamente al concentrado celular congelado y mantenido sobre hielo. Mezclar la suspensión con suavidad y purificar el ADN con 250 μl de fenol equilibrado/cloroformo/alcohol isoamílico (PCI, por su sigla en inglés), en una relación 25:24:1.

2. Separar las fases mediante centrifugación a 800 g durante 2 minutos en minicentrífuga. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo, en el cual se realiza una segunda purificación con un volumen de cloroformo.

3. Precipitar el ADN de la segunda fase acuosa en acetato de amonio 2 M (ver anexo 32) y dos volúmenes de etanol absoluto a 20 °C. Mezclar por inversión muy suavemente e incubar durante toda la noche a -20 °C.

4. Centrifugar a 1000 g y 4 °C durante 5 minutos. Resuspender el sedimento obtenido en 500 μl de etanol al 70 % e incubar durante 10 minutos a 20 °C. Centrifugar a 1500 g y 4 °C durante 10 minutos.

5. Evaporar completamente el etanol. Resuspender el ADN en 100 µl de buffer Tris Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, por su sigla en inglés) 10 mM (ver anexo 33).

6. Correr una electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % (ver anexo 34) y almacenar el ADN extraído a -20 °C hasta su utilización en la PCR.

7. Cuantificar el ADN mediante espectrofotometría.

Protocolo de reacción en cadena de polimerasa

1. Realizar la amplificación en un volumen final de 20 µl. Los cálculos por muestra son: 2 µl de buffer 1X (Sigma®), 1 μl de mezcla de dNTP’s 1.25 mM (Invitrogen®), 2.4 µl de MgCl2 6 mM (TucanTaq®), 0.2 μl de cada uno de los tres oligos 0.2 µM, 0.2 μl de polimerasa Taq (TucanTaq®) 0.05 U/µl, 4 μl de ADN y agua ultrapura estéril para completar el volumen final.

2. Iniciar la programación del termociclador con una primera desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 1 minuto, 58 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 1 minuto, y una extensión final a 72 °C durante 10 minutos.

3. Utilizar geles de agarosa al 1.5 % (ver anexo 35) teñidos con bromuro de etidio para la visualización de productos de la electroforesis corrida a 105 V/cm durante 45 minutos. La combinación de oligonucleótidos en una misma mezcla de reacción genera productos de 166 pb para el ADN de E. histolytica y de 752 pb para el ADN de E. dispar.

La secuencia del oligonucleótido sentido (EntaF) se diseñó sobre la región central de la subunidad pequeña del gen rRNA, la cual está conservada en ambas especies de Entamoeba, mientras que los oligonucleótidos antisentido (EhR y EdR), específicos para E. histolytica y E. dispar, se diseñaron según las secuencias variables de la subunidad pequeña del rRNA 16S. Las secuencias son EntaF: 5’-ATG CAC GAG AGC GAA AGC AT-3’; EhR: 5’-GAT CTA GAA ACA ATG CTT CTC T-3’, y EdR: 5’-CAC CAC TTA CTA TCC CTA CC-3’. La especificidad de los oligonucleótidos se establece al comparar con la totalidad de secuencias disponibles en GenBank, donde el oligonucleótido sentido (EntaF) se encuentra solo en el género Entamoeba y los oligonucleótidos antisentido (EhR y EdR), en secuencias específicas de cada una de las especies del complejo (53).