Читать книгу Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología - Myriam Consuelo López Páez - Страница 27

Para el diagnóstico de la amibiasis extraintestinal, se utilizan pruebas inmunológicas que detectan anticuerpos. A pesar de que estos anticuerpos permanecen durante largo tiempo en el suero, su asociación con los hallazgos clínicos e imagenológicos es fundamental para el diagnóstico etiológico correcto (54). Entre las pruebas más utilizadas, se pueden hallar la aglutinación en látex, inmunodifusión (ID), contrainmunoelectroforesis (CIE), hemaglutinación indirecta (HAI), ELISA y western blot (WB).

La identificación de E. histolytica se lleva a cabo en material del absceso hepático, peritoneo, material expectorado y piel. Entre las fortalezas de estas pruebas figura su aporte en el desarrollo de estudios seroepidemiológicos, que indican el nivel de saneamiento básico de la población (33,55).

Técnicas inmunológicas

Las técnicas inmunológicas que se utilizan de rutina para la detección de anticuerpos son ID, CIE y ELISA.

Inmunodifusión

La inmunodifusión, llamada también análisis de Ouchterlony, es una técnica de precipitación sencilla basada en el principio de la reacción antígeno-anticuerpo, en la cual el antígeno soluble y el anticuerpo homogenizado se difunden a través de un medio semisólido y forman complejos inmunes estables que pueden ser visualizados como una banda de precipitación. Este método se realiza sobre agar en una caja de Petri o una placa de vidrio y las soluciones de antígeno y anticuerpo se colocan en pozos adyacentes, permitiendo que difundan el uno hacia el otro (56).

La localización de las bandas de precipitación depende de las concentraciones relativas de antígeno y anticuerpo que se colocan en los pozos. Si la concentración del antígeno es menor que la del anticuerpo, entonces el anticuerpo se difundirá más lejos del pozo para reaccionar con el antígeno. Si el anticuerpo está relativamente diluido en comparación con el antígeno, las bandas de precipitación tienden a formarse más cerca del pozo que contiene el anticuerpo. Asimismo, el tamaño molecular del antígeno y del anticuerpo influye en la formación de las bandas de precipitación. Los componentes de alto peso molecular, tales como las moléculas de IgG, tienden a difundirse con lentitud en el gel y, por lo tanto, sus bandas de precipitación se formarán más cerca al pozo donde están estos anticuerpos (56). La figura 1.4. esboza los tres patrones de bandas de precipitación posibles en la inmunodifusión y la explicación de cada resultado.

A. Reacción de identidad: existe identidad inmunoquímica antígeno-anticuerpos y se forma una sola línea de precipitado. Puede ser utilizada como una evaluación cuantitativa de la pureza del antígeno y del anticuerpo.

B. Reacción de no identidad: no existe identidad entre los anticuerpos y el antígeno. Se visualiza porque las líneas de precipitación se cruzan completamente.

C. Reacción de identidad parcial: sugiere identidad parcial de los anticuerpos y el antígeno (los determinantes antigénicos son compartidos parcialmente por los anticuerpos); se forma una línea que no se cruza

Figura 1.4 Montaje, patrones de bandas de precipitación e interpretación de resultados en la inmunodifusión.

Fuente: cortesía de Andrés Melo.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: cajas de Petri, micropipetas automáticas y puntas, pipetas, balón volumétrico, tapón de algodón forrado con papel aluminio, perforador en forma de margarita, agujas con bisel, agarosa al 1.3 % (ver anexo 36) y solución salina al 0.85 % (ver anexo 1).

Procedimiento

1. Servir 25 µl de antígeno de E. histolytica en el pozo central del gel de agarosa al 1.3 %. En uno de los pozos laterales, servir 25 µl del suero control positivo y en otro pozo, servir la misma cantidad del suero control negativo. De cada suero problema se sirven 25 µl en los pozos restantes. Es necesario dibujar un esquema de la ubicación de los sueros en el agar para consultarlo a la hora de la interpretación.

2. Incubar las muestras en el agar en cámara húmeda bien tapada a 37 °C entre 12 y 18 horas.

3. Colocar la placa en una solución de citrato de sodio al 5 % durante 1 hora a fin de eliminar las bandas inespecíficas.

4. Leer con transiluminación. Los resultados se interpretarán de acuerdo con los patrones de bandas de precipitación descritos en la figura 1.4.

Los resultados se reportan como reactivo (RE) o no reactivo (NR), describiendo el patrón de bandas de precipitación.

Coloración de la placa

Para visualizar mejor las bandas se puede colorear la placa con amido black.

▪ Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: placa de inmunodifusión, papel filtro, solución salina al 0.85 % (ver anexo 1), agua destilada, amido black al 0.7 % (ver anexo 37), solución de lavado (ver anexo 38) y citrato de sodio al 5 % (ver anexo 39).

▪ Procedimiento

1. Dejar la placa de id en solución salina al 0.85 % durante 18 horas.

2. Lavar con agua destilada durante 10 minutos.

3. Colocar un papel de filtro húmedo sobre la placa de agarosa y llevarla a 37 °C hasta que seque por completo.

4. Colocar la placa en amido black durante 10 minutos.

5. Lavar con agua destilada.

6. Dejar en solución de lavado hasta visualizar las bandas.

7. Colocar el gel en solución de citrato de sodio al 5 % para eliminar las bandas inespecíficas.

La observación de una sola banda de precipitación en la muestra problema se considera una reacción positiva.

Contrainmunoelectroforesis

Esta prueba fue descrita por primera vez en 1970 y desde entonces se ha utilizado para diagnosticar muchas enfermedades virales y parasitarias. Esta técnica se basa en la migración del antígeno y el anticuerpo y la formación de una banda de precipitación en un campo eléctrico. Es una prueba rápida, sensible y que requiere volúmenes mínimos de antígeno y anticuerpo. La sensibilidad de la prueba depende en gran medida de la estandarización de condiciones, como la determinación de las concentraciones óptimas de antígeno y anticuerpo, la selección adecuada del tipo de gel, el pH del buffer (8.2–8.6) y la ubicación adecuada de las muestras en los pozos para facilitar el contacto entre los reactantes (57).

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: pipetas de 10 ml y 20 ml, capilares, pipetas Pasteur, papel de filtro Whatman N.° 2, placas de vidrio, cámara para electroforesis, fuente de poder, agarosa al 1.3 % en solución amortiguadora con pH 8.6 (ver anexo 40), ácido acético glacial, amido black (ver anexo 37), solución de lavado (ver anexo 38), metanol y solución amortiguada 0.05 M con pH 8.6 (ver anexo 41).

Procedimiento

1. Cubrir una placa de vidrio de 8.5 cm x 10 cm con agarosa al 1.3 % en solución amortiguada 0.05 M, pH 8.6.

2. Incubar la placa en cámara húmeda por 30 minutos para permitir la solidificación del gel y, después, perforar pozos de 3 mm de diámetro en el agar con 4 mm de separación entre ellos.

3. Colocar el antígeno en su concentración óptima en la columna de la derecha. Hacer diluciones del suero problema (1:2 a 1:64) y disponerlas en la columna de la izquierda. Ubicar los sueros control positivo y negativo en los pozos inferiores.

4. Agregar 2 L de solución amortiguada 0.05 M, pH 8.6 en la cámara de electroforesis y ubicar dentro la placa de vidrio con las muestras.

5. Correr la electroforesis durante 60 minutos a un voltaje constante de 110 V a 140 V y un amperaje de 4 mA a 8 mA.

Antes de correr la CIE, es importante asegurarse de que los puentes de contacto y todos los demás componentes de la cámara estén bien colocados. No se debe conectar a la energía eléctrica hasta que la cámara esté llena y los contactos, revisados.

6. Desconectar la cámara de electroforesis luego de 60 minutos y colocar la placa de vidrio en agua destilada por 5 minutos. En este momento, deben observarse las bandas de precipitación de los controles, así como las bandas de precipitación de la muestra, en caso de que esta sea positiva.

7. Cubrir con papel de filtro húmedo y secar a 37 °C durante 12 horas, si se desea conservar la placa o fotografiar. Eliminar el papel de filtro y colorear la placa con amido black al 0.7 % durante 10 minutos, lavar con agua y dejar la placa 10 minutos en solución de lavado. El último lavado se realiza con agua destilada durante 5 minutos.

La presencia de una banda de precipitación se considera una reacción positiva. El título de la muestra está definido por la última dilución en la cual se observa esta banda.

Ensayo inmunoenzimático

Como se explicó en el aparte sobre el diagnóstico de Toxocara canis usando la técnica ELISA, esta prueba permite determinar la concentración de un antígeno o un anticuerpo en la muestra, mediante el uso de uno de ellos en fase sólida y el otro, en solución. La detección de la reacción antígeno-anticuerpo se realiza con una enzima (fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa oxidasa o beta-D-galactosidasa) que reacciona con un sustrato específico y, de acuerdo con este mismo sustrato, se detiene la reacción usando ácidos o bases fuertes. La concentración de los productos enzimáticos se obtiene a través de la lectura de la densidad óptica en espectrofotómetro a la longitud de onda en la cual el color formado presenta su máxima absorción (58).

La detección de anticuerpos es la técnica que se usa con mayor frecuencia en Colombia. En el caso particular de la detección de anticuerpos anti-E. histolytica, el antígeno preparado a partir de cultivos axénicos de la cepa HM1:IMSS se fija en la fase sólida y luego se agrega la muestra (suero) en la que se sospecha que está el anticuerpo a determinar. Más adelante, se agrega el conjugado (anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina) dirigido contra el anticuerpo específico. Posteriormente, se añade el sustrato de la enzima, produciéndose una reacción colorimétrica cuantificada con espectrofotómetro. Al estandarizar la prueba, se establece el punto de corte con el cual se indica la positividad o negatividad de la muestra (55). A continuación, se describen las condiciones de trabajo estandarizadas en Colombia para esta prueba.