Читать книгу Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología - Myriam Consuelo López Páez - Страница 28

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: placas de poliestireno de 96 pozos Immulon I, papel secante, nevera, cronómetro, micropipetas automáticas y puntas, frasco lavador, antígeno de E. histolytica (ver anexo 42), solución reguladora de revestimiento 0.05 M pH 9.6 (ver anexo 12), solución reguladora de fosfato (PBS) 0.15 M pH 7.4 (10X) (ver anexo 13), solución reguladora de fosfato (PBS) 0.15 M pH 7.4 más Tween 20 (PBS-T20) (ver anexo 14), solución reguladora de dietanolamina pH 9.8 (ver anexo 15) e hidróxido de sodio 3N (ver anexo 16).

Condiciones de trabajo utilizadas en Colombia

A continuación, se presentan las condiciones de trabajo estandarizadas en el laboratorio, para la realización del ELISA.

• Antígeno: se prepara a partir de cultivos axénicos de la cepa HM1:IMSS. La concentración de trabajo estandarizada para ELISA es de 1.25 µg/ml.

• Suero: la dilución estandarizada de suero es de 1:400, es decir, una parte de suero por 400 partes de solución de trabajo PBS-T20. Esta dilución es la misma para las muestras problema y los sueros controles (positivo y negativo).

• Conjugado: anti-IgG humana marcada con fosfatasa alcalina en una dilución de 1:15 000, es decir, una parte de conjugado por 15 000 partes de solución de trabajo PBS-T20. Esta concentración puede ser ajustada en función de la marca del anticuerpo conjugado.

• Sustrato: el sustrato de la fosfatasa alcalina es una solución de paranitrofenilfosfato en solución reguladora de dietanolamina pH 9.8, en proporción 1:1 w/v (1 mg de sustrato/1 ml de solución). La reacción se detiene con NaOH 3N.

• Punto de corte: el punto de corte de esta prueba diagnóstica es 0.34. Muestras con absorbancias mayores o iguales a 0.34 son consideradas positivas.

Procedimiento

1. Agregar 100 µl de la solución reguladora de revestimiento en cada pozo con el antígeno de E. histolytica.

2. Incubar las microplacas en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 3 horas.

3. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

4. Agregar 100 µl de las diluciones de los sueros problema. Las muestras se sirven por triplicado. Se dejan seis pozos de la placa libres, de los cuales tres serán utilizados como control de antígeno y los tres restantes, control de conjugado. Los seis pozos de control se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 2 horas.

5. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por lavado.

6. Agregar 100 µl de la dilución del conjugado en cada pozo, excepto en los tres pozos que sirven como control de antígeno; estos pozos se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a 4 °C durante 18 horas.

7. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

8. Agregar 100 µl de la solución de sustrato en cada uno de los pozos.

9. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos y detener la reacción añadiendo 25 µl de NaOH 3N a cada pozo.

10. Leer la absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Confrontar las lecturas obtenidas con el valor de punto de corte establecido, revisar los resultados del control positivo y negativo y hacer el reporte correspondiente.

Los resultados se reportan como reactivo (RE) o no reactivo (NR), colocando en todos los casos el dato de la absorbancia. El formato debe incluir un párrafo de interpretación que especifique el punto de corte de la técnica empleada. Se consideran valores de absorbancia positivos mayores o iguales a 0.34, mientras que los valores de absorbancia menores a esta cifra son negativos. En la figura 1.2 se esquematiza el procedimiento ELISA indirecto para la detección de anticuerpos tipo IgG anti-E. histolytica.

Hemaglutinación indirecta

En esta técnica se utilizan glóbulos de carnero previamente tratados con ácido tánico y sensibilizados con antígeno de E. histolytica en presencia del suero problema con sospecha de amibiasis (59).

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: antígeno de E. histolytica (ver anexo 42), glóbulos rojos, glutaraldehído al 1 % (ver anexo 43), solución salina al 0.85 % (ver anexo 1), PBS pH 7.2 (ver anexo 44), ácido tánico en dilución 1:15 000 (ver anexo 45) y azida de sodio al 1 % (ver anexo 46).

Procedimiento

▪ Tratamiento de las células rojas con glutaraldehído

1. Centrifugar la sangre total de carnero por 3 minutos a 800 g.

2. Lavar los glóbulos rojos tres veces con solución salina al 0.85 % a 800 g durante 5 minutos.

3. Mezclar el precipitado con glutaraldehído al 1 %.

4. Incubar a 4 °C en agitación durante 30 minutos (agitador magnético).

5. Eliminar el glutaraldehído por centrifugación.

6. Lavar los glóbulos rojos cinco veces con agua destilada y cinco veces con solución salina fría al 0.85 %.

7. Utilizar las células en solución salina para preparar una dilución de células al 20 % con azida de sodio al 1 % y almacenar a 4 °C.

▪ Tratamiento de las células rojas con ácido tánico

1. Centrifugar las células rojas mantenidas en azida de sodio al 1 % durante 10 minutos a 800 g para concentrarlas al 100 %.

2. Diluir las células a una concentración de 2 % con solución salina fría al 0.85 %.

3. Mezclar la solución de células al 2 % y el ácido tánico 1:15 000 en proporción 1:1 (volumen a volumen o v/v).

4. Incubar a 37 °C durante 40 minutos.

5. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos y lavar dos veces con solución salina fría al 0.85 % para eliminar el exceso de ácido tánico y concentrar los glóbulos rojos al 100 %.

▪ Sensibilización de glóbulos rojos

1. Diluir el antígeno de E. histolytica a su concentración óptima utilizando PBS pH 7.2.

2. Diluir los glóbulos rojos tratados con ácido tánico y concentrados al 100 % en la dilución óptima del antígeno hasta obtener una concentración de células del 2 %.

3. Incubar a 37 °C durante 50 minutos, mezclando simultáneamente.

4. Centrifugar y lavar las células dos veces en solución salina al 0.85 %.

5. Suspender los glóbulos rojos al 2 % en solución salina al 0.85 %.

▪ Titulación del antígeno de E. histolytica

1. Realizar diluciones seriadas del antígeno (1:2) en PBS pH 7.2, partiendo de una dilución 1:10 y finalizando en 1:40.

2. Aplicar la técnica de microhemaglutinación con los correspondientes sueros controles positivos y negativos.

La dilución óptima del antígeno es la dilución máxima capaz de reaccionar con la dilución más alta del suero control positivo.

▪ Técnica de microhemaglutinación

1. Inactivar los sueros de control (positivo y negativo) y los sueros problema a 56 °C durante 30 minutos.

2. Preparar una dilución de suero de conejo al 2 % en PBS pH 7.2.

3. Agregar 50 µl de suero de conejo diluido al 2 % a 12 pozos de la placa de microtitulación.

4. Agregar 50 µl de cada suero inactivado en los pozos destinados a los sueros problema, control positivo y control negativo.

5. Realizar diluciones sucesivas, transfiriendo 50 µl a los pozos inferiores hasta obtener una dilución 1:4000 y eliminar la última dilución.

6. Agregar 25 µl de glóbulos rojos sensibilizados con el antígeno de E. histolytica a todos los pozos.

7. Mezclar con suavidad por agitación, dejar en reposo de 2 a 3 horas y cubrir la placa con papel celofán.

8. Realizar la lectura de la prueba. Si existen anticuerpos contra E. histolytica, se observará una malla de aglutinación, lo que se considera una prueba positiva en la dilución correspondiente. En la prueba negativa, se observa un punto en el fondo del pozo.

Western blot

El western blot es una técnica inmunológica que ayuda a determinar la presencia de proteínas de cierto peso molecular en pacientes con infección por E. histolytica reciente o pasada. En un estudio realizado en pacientes colombianos diagnosticados con absceso hepático amibiano, se identificó una banda de 38 kDa en el 93 % de los pacientes, una de 42 kDa en el 90 % y una de 80 kDa en el 86 %. En pacientes con absceso hepático mixto, las bandas de 80 kDa y 38 kDa fueron identificadas en el 100 % de los pacientes y la de 42 kDa, en el 75 % de ellos (60).

En otro estudio, que evaluó la frecuencia de bandas entre pacientes con infección reciente y pasada por E. histolytica, se encontraron bandas de 136 kDa, 132 kDa, 93 kDa, 70 kDa y 62 kDa en pacientes con absceso hepático amibiano, y bandas de 144 kDa, 140 kDa y 94 kDa asociadas con infección pasada (61). La figura 1.5 muestra el procedimiento de la realización de western blot para la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE, por su sigla en inglés) en medio discontinuo denaturante y la detección de anticuerpos anti-E. histolytica.

Figura 1.5. Procedimiento para la realización del western blot.

Fuente: cortesía de Olga Lucía Morales Reyes.

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico en medio discontinuo denaturante

▪ Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: un par de vidrios con separadores; un peine del grosor de los separadores; un par de sujetadores (clamps) para vidrios; un stand para colocar el sándwich de electroforesis; cámaras de electroforesis; fuente de poder ajustable a corriente continua; tubos plásticos para centrífuga; baño serológico a ebullición; agua bidestilada; agua saturada con N-butanol (ver anexo 47) —este reactivo es opcional—; solución A: monómero para gel de separación (ver anexo 48); solución B: buffer para gel de separación (ver anexo 49); solución C: monómero para gel de stacking (ver anexo 50); solución D: buffer para gel de stacking (ver anexo 51); persulfato 2 % (ver anexo 52); gel de sellado (ver anexo 53); gel de corrido o separación (ver anexo 54); gel de stacking (ver anexo 55); buffer de Laemmli 2X o 4X (ver anexo 56); buffer de corrido (ver anexo 57); pipetas de 10 ml; micropipetas; tetrametiletilendiamina (TEMED); puntas para micropipetas; pipeteador; bisturí; guantes, y tapabocas.

▪ Precaución

Se debe siempre utilizar guantes de protección química EN374, a fin de evitar que los vidrios se engrasen y para protección personal, ya que los monómeros de acrilamida son neurotóxicos.

▪ Procedimiento

1. Lavar los vidrios, preferiblemente, con detergente 1A y agua abundante y manipularlos con sumo cuidado.

2. Secar los vidrios con papel absorbente, teniendo la precaución de que no queden residuos de grasa, jabón o papel.

3. Ensamblar la cámara de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4. Preparar 1 ml de persulfato de sodio al 2 %.

▪ Preparación del gel de sellado

1. Preparar el gel de separación sin aplicar persulfato ni TEMED. Para ello, agregar agua bidestilada, solución A y B.

2. En otro recipiente, separar 1 ml de la mezcla para gel de separación y agregar el persulfato y el TEMED. Servir con rapidez para evitar la polimerización.

3. Agregar 300 µl de la mezcla del gel de sellado en el sándwich de los vidrios, procurando hacerlo con rapidez y por las esquinas del montaje. Esperar que el gel polimerice de 20 a 30 segundos.

▪ Preparación del gel de separación

1. Agregar persulfato y TEMED a la solución de gel de separación restante.

2. Añadir la solución al sándwich de vidrios. Para ello, se utiliza una micropipeta de 1 ml (mínimo) y se vierte la solución con rapidez por las esquinas del montaje; se agregan aproximadamente 4 ml entre los vidrios a fin de dejar libre el espacio correspondiente al gel de stacking.

3. Agregar 450 µl etanol antes de que la acrilamida se polimerice. El etanol formará una capa a nivel a través de la superficie del gel en 1 o 2 minutos. Cuando el gel se polimerice, se observará una interfase nítida entre el etanol y el gel. En ese momento, retirar el etanol y secar con papel filtro.

4. Si el gel no se va a utilizar el mismo día, agregar agua bidestilada y 1 ml de solución B diluida 1:4. Almacenar el gel a 4 °C.

▪ Preparación del gel de stacking

1. Preparar la solución de gel de stacking.

2. Agregar la solución al sándwich de vidrios como se explicó antes. Por cada gel se utilizan aproximadamente 2.5 ml de esta solución. Llenar por completo el espacio disponible en el sándwich para este gel.

3. Introducir con cuidado el peine de plástico y evitar la formación de burbujas, porque inhiben la polimerización de la acrilamida y causan distorsión local en el fondo de los pozos.

4. Esperar por lo menos 10 minutos a que el gel polimerice.

Se recomienda no correr patrones de peso molecular en los pozos de los extremos del gel.

▪ Preparación de la muestra

1. Mezclar tres partes de la muestra con una parte de buffer Laemmli 4X; si el buffer es 2X, la relación entre muestra y buffer es de 1:1. Mezclar y llevar a ebullición durante 5 minutos. Ejemplo: 80.33 µl de antígeno + 66.67 µl PBS 1X + 50 µl buffer Laemmli 4X.

2. Retirar el peine. Para correr una sola muestra se pueden cortar los dientes restantes con bisturí, limpiando bien los restos del gel. Llevar a cabo el montaje del sándwich en la cámara de electroforesis.

3. Agregar buffer de corrido entre los bloques de la cámara para verificar que no se salga.

4. Colocar el sándwich y la cámara superior en su sitio, llenar con buffer de corrido por dentro y por fuera de la cámara hasta aproximadamente la mitad del nivel de contenedor.

5. Servir la muestra en los pozos con una pipeta. El patrón puede depositarse en uno de los pozos centrales del gel.

▪ Corrido electroforético

1. Colocar los electrodos en su lugar, asegurando que el cátodo quede en la parte superior.

2. Fijar la fuente de poder en la selección de corriente constante.

3. Correr la electroforesis inicialmente a 75 V por 15 minutos aproximadamente y cuando la muestra se acumule al fondo de los pozos, cambiar a un voltaje constante de 125 V. Dejar que el corrido continúe bajo estas condiciones durante 1 hora.

4. Detener el corrido cuando el frente de color esté en el borde del gel.

5. Sacar la cámara del contenedor y continuar con la transferencia.

Electrotransferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa

▪ Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: cámara de electrotransferencia, dos hojas de papel Whatman de 3 mm x 14 cm x 16 cm, una hoja de papel de nitrocelulosa de 14 cm x 16 cm, buffer de transferencia (ver anexo 58), guantes, tubo de ensayo grande y cuarto frío o recipientes con hielo para enfriar la cámara de transferencia.

▪ Procedimiento

Precaución: utilizar guantes durante todo el procedimiento y manipular con cuidado el papel de nitrocelulosa para evitar que se ensucie. Iniciar el procedimiento lo más pronto posible después de terminar la electroforesis, a fin de disminuir la difusión de bandas.

1. Llenar la cámara de electrotransferencia con cantidad suficiente de buffer de transferencia.

2. Depositar el gel de corrido —el gel de stacking no es necesario para la transferencia— sobre una de las hojas de papel Whatman y colocarlo sobre una de las rejillas con espuma.

3. Colocar el papel de nitrocelulosa encima del gel y eliminar las burbujas. Colocar encima la otra hoja de papel Whatman y hacer presión sobre el montaje, al rodar un tubo de ensayo limpio sobre el papel Whatman para eliminar las burbujas entre el gel y el papel de nitrocelulosa.

4. Colocar encima la otra espuma y la otra rejilla. Asegurar el montaje y colocarlo en la cámara de electrotransferencia, confirmando que el papel de nitrocelulosa quede hacia el ánodo (+).

5. Programar las condiciones de la transferencia. Si se realiza con dos membranas se programan 150 mA durante 2 horas y media, mientras que, para un solo gel, se tarda 1 sola hora. La transferencia se hace a 4 °C, ya que el proceso puede ocasionar el calentamiento excesivo de la cámara.

Coloración de la transferencia con rojo Ponceau

▪ Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: rojo Ponceau (ver anexo 59), agua bidestilada, refractaria y solución para lavados (ver anexo 60).

▪ Procedimiento

1. Colocar la membrana en una refractaria limpia.

2. Lavar la membrana de nitrocelulosa con agua bidestilada.

3. Añadir rojo Ponceau en cantidad suficiente para cubrir la membrana y dejar en remojo durante 5 minutos.

4. Decolorar la membrana con agua bidestilada o solución de lavado para inmunoblot. Comprobar la aparición de bandas coloreadas de rojo, lo que indica el éxito de la transferencia. Lavar hasta que las bandas desaparezcan por completo.

Inmunoblot y revelado con fosfatasa

▪ Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: solución de trabajo PBS+Tween 20 PBS-T20 (ver anexo 14), solución para lavados (ver anexo 60), solución bloqueadora de actividad endógena (ver anexo 61), solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión (ver anexo 62) y solución activadora de la fosfatasa y solución reveladora (ver anexo 63).

▪ Procedimiento

1. Cortar la membrana en tiras de 0.6 cm de ancho, con cuidado de no cortar por el medio del frente de corrida de las bandas. Identificar uno de sus extremos con una marca de lápiz y colocar las tiras en tubos de ensayo limpios y llenos de agua bidestilada.

2. Colocar las tiras en solución bloqueadora de actividad endógena por 1 hora y luego realizar tres lavados con solución de lavado durante 5 minutos.

3. Colocar las tiras en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión y mantener a 4 °C y en agitación constante durante toda la noche; esto permite que las proteínas de la leche utilizada en la solución bloqueadora se peguen a los espacios vacíos de la membrana. El bloqueo también puede realizarse a 37 °C durante 1 hora.

4. Diluir la muestra (suero o sobrenadante) en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión recién preparada. La dilución del suero depende de la concentración de anticuerpos de este y de la concentración de proteínas en la transferencia, por lo cual inicialmente se deben probar diferentes diluciones (1:50, 1:100).

5. Incubar a 4 °C toda la noche o 1 hora a temperatura ambiente, con agitación constante. Luego, lavar la membrana cinco veces por 5 minutos en cada oportunidad con solución de trabajo PBS-T20.

6. Diluir el conjugado (anti-IgG o anti-IgM) en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión. La dilución del conjugado se ajusta según la resolución de las bandas y el background obtenido. Por lo general, se recomiendan diluciones de conjugado de 1:2000, 1:10 000 o 1:20 000, según las indicaciones de cada casa comercial.

7. Incubar 1 hora a temperatura ambiente y en agitación constante. Posteriormente, lavar cinco veces durante 5 minutos en cada ocasión, con PBS-T20.

▪ Revelado con fosfatasa alcalina

1. Lavar la membrana con solución activadora por 10 minutos.

2. Adicionar la solución reveladora y detener la reacción cuando las bandas muestren buena visibilidad. Este procedimiento se lleva a cabo a temperatura ambiente.

3. Preparar el volumen necesario de solución reveladora. Para prepararla, por cada 10 ml de solución activadora, agregar 33 µl de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) y 66 µl de nitro azul de tetrazolio (NBT).

4. Descartar la solución reveladora restante (ver figura 1.5).