Читать книгу Jahrbuch der Baumpflege 2020 - Группа авторов - Страница 51

2.1 Bisherige Nachweisverfahren für ALB

Der Diagnosestandard PM 7/129 der Europäischen und Mediterranen Pflanzenschutzorganisation (EPPO) beinhaltet validierte Protokolle zur molekularbiologischen Diagnose von Arthropoden, darunter auch Anoplophora glabripennis (ALB) (EPPO 2016). Dabei ist vorgesehen, aus gesammelten und ins Labor überführten Entwicklungsstadien (beispielsweise aus Larven) DNA zu extrahieren, daraus anschließend mittels PCR (siehe 2.2) DNA von Markergenen zu vervielfältigen und diese zur Identifikation zu sequenzieren. Eines dieser sogenannten Barcoding-Gene zur Unterscheidung verschiedener Arten codiert die Untereinheit 1 der Cytochrom C Oxidase (COI). Die sequenzierte Region dieses Gens erlaubt eine eindeutige Zuordnung der untersuchten Probe zum ALB und darüber hinaus sogar die Differenzierung einzelner geographischer Populationen. Am Julius Kühn-Institut werden zur Unterstützung der deutschen Pflanzenschutzdienste diagnostische Analysen kritischer Verdachtsfälle durchgeführt. Neben einer morphologischen Bestimmung eingesandter ALB-Larven hat sich der routinemäßige Einsatz des EPPO PM 7/129-Protokolls für die molekulare, PCR-basierte Diagnose bewährt. Das Schema in Abbildung 1 zeigt, unter welchen Bedingungen der EPPO Standard PM 7/129 (mitsamt der zugehörigen Primer) verwendet werden kann, um ALB zu diagnostizieren, und wann es ratsam ist, mit spezifischeren Primern zu arbeiten. Das beschriebene Vorgehen setzt aber i. d. R. das Vorhandensein von ALB-Stadien voraus.

Abbildung 1: Übersicht über die folgenden Abbildungen und vereinfachte Darstellung des Arbeitsablaufs der molekularbiologischen Diagnose von ALB aus verschiedenen Ausgangsmaterialien; * Inhibitoren = störende Stoffe, die eine Untersuchung mittels PCR hemmen, u. a. phenolische Gerbstoffe vieler Wirtsbaumarten

2.2 Diagnose von Schadinsekten aus Larvenmaterial mittels PCR

Die PCR ist eine Kettenreaktion zur Vervielfältigung (Amplifikation) eines Ziel-DNA-Abschnittes (Template) mittels des Enzyms Polymerase (daher englisch Polymerase Chain Reaction). Sind durch die PCR ausreichend viele Kopien der Ziel-DNA generiert worden, kann die Basenreihenfolge der DNA im nächsten Untersuchungsschritt bestimmt (sequenziert) und der Schadorganismus dann zumeist eindeutig identifiziert werden. Damit die Polymerase ausschließlich die Ziel-DNA und keine ungewollten DNA-Regionen amplifiziert, werden sogenannte Primer, dem Laborpraktiker bekannte, kurze, künstlich hergestellte DNA-Stücke, sogenannte Nukleotide, benötigt, die am Beginn und Ende der Ziel-DNA binden und der Polymerase den Umfang der Zielregion vorgeben. Primer können Artspezifisch sein, so dass sie nur an die DNA der gewünschten Spezies binden, oder ausreichend unspezifisch sein, um an die DNA vieler verschiedener Organismen binden zu können.

Die quantitative PCR (kurz qPCR) unterscheidet sich von der herkömmlichen PCR durch Fluoreszenz-Messungen während der DNA-Amplifikation. Ermöglicht wird dies durch eine fluoreszierende sogenannte TaqMan-Sonde, die in einer herkömmlichen PCR nicht zum Einsatz kommt. Da die Fluoreszenz proportional zur Menge der PCR-Produkte ist, kann die Vervielfältigung der DNA in Echtzeit beobachtet werden und so eine Aussage über eine statistisch signifikante Amplifikation getroffen werden. Das bedeutet, dass auch sehr geringe DNA-Mengen (wie sie in Fraß und Nagerückständen vorhanden sind) noch nachgewiesen werden können.

Die Cytochrom C Oxidase ist ein überlebenswichtiger, an der Zellatmung beteiligter Enzymkomplex, der bei allen Eukaryonten (inkl. Tieren, Pflanzen und Pilzen) aus 13 Untereinheiten besteht. Das die Untereinheit 1 (COI) codierende Gen COI ist über weite Abschnitte hochkonserviert und wird häufig zur stammesgeschichtlichen (phylogenetischen) Einordnung von Organismen verwendet. Die Primer des EPPO Standard PM 7/129 Protokolls, mit den Namen „LCO1490“ und „HCO2198“, wurden so designt, dass sie an die DNA des COI-Gens möglichst vieler Eukaryonten binden. Solange ausreichend Ei- bzw. Larvenmaterial oder adulte Insekten (ohne assoziierte Mikroorganismen) zur Verfügung stehen, ist der EPPO Standard PM 7/129 für die Diagnose von ALB ebenso geeignet wie für andere Bockkäfer und auch Schmetterlinge wie bspw. Blausieb (Zeuzera pyrina) und Weidenbohrer (Cossus cossus), die im befallenen Holz ganz ähnliche Symptome wie der ALB hinterlassen. Jedoch unterscheiden sich diese Arten morphologisch ohnehin so deutlich, dass bei ausreichend Larvenmaterial kaum eine Verwechslungsgefahr besteht (Abbildung 2).

Abbildung 2: A) Blausieb (Zeuzera pyrina) B) Weidenbohrer (Cossus cossus) C) ALB: Ei und Larve (kleines Fenster)

Bei Fraß und Nagespänen (Abbildung 3) sieht es anders aus, hier ist eine morphologische Bestimmung kritisch und eine molekularbiologische Diagnose wünschenswert bzw. dringend erforderlich.

Für den Fall, dass ein ALB-Verdacht ausschließlich auf morphologischen Symptomen an verletzten Bäumen beruht und keine ALB-Stadien verfügbar sind, haben wir eine neue Methode entwickelt, die den Nachweis von ALB aus Fraß oder Nagespänen ermöglicht, auch wenn sie nur winzige DNA-Mengen enthalten.

Abbildung 3: ALB in Ahornholz; Fraß und Nagespäne finden sich zuhauf, verpresst innerhalb der Larvengänge (A, B, D) oder unverpresst außerhalb des ursprünglichen Eingangsbereichs (C).

2.3 Probleme bei der ALB-Diagnose aus Holz

Die Extraktion von Insekten-DNA aus Holzmaterial impliziert die Anwesenheit von PCR-inhibierenden Substanzen wie Lignin und erfordert daher eine Anpassung des Protokolls zur Probenaufbereitung (SCHRADER et al. 2012). Um den PCR-inhibierenden Effekt zu minimieren, gibt es zwei Möglichkeiten: Entweder werden inhibierende Substanzen durch zusätzliche Reinigungsschritte während der DNA-Extraktion eliminiert oder es wird ein Polymerase Master Mix verwendet, der so robust ist, dass die Polymerase auch in Anwesenheit der Inhibitoren ihre Arbeit verrichten kann. Grundsätzlich ist es ratsam, schon während der DNA-Extraktion möglichst viele Inhibitoren zu beseitigen.