Читать книгу Jahrbuch der Baumpflege 2020 - Группа авторов - Страница 53

4.1 Warum eignen sich COI-Barcoding-Primer nicht zur Diagnose von ALB aus Nagespänen und Fraß?

Die COI-Barcoding Region umfasst eine Länge von 709 Basenpaaren. Oftmals ist die aus dem Holz extrahierte DNA jedoch zu kürzeren Fragmenten abgebaut bzw. de-generiert. Dies hat zur Folge, dass eine PCR negativ verläuft und keine Ziel-DNA amplifiziert wird. Wenn jedoch die Amplifikation von DNA des COI-Gens aus ALB-befallenem Holz gelingt, ist es andererseits möglich, dass sie nicht ausschließlich von ALB, sondern von verschiedenen eukaryotischen Organismen stammt, weil die im EPPO Standard PM 7/129-Protokoll empfohlenen Primer bspw. auch an die DNA von Pilzen und Oomyceten binden, mit denen ALB-besiedeltes Holz und ALB-Nagespäne häufig befallen sind (Abbildung 5A).

Abbildung 5: A) ALB-befallenes Holz mit Symptomen von Pilz- bzw. Oomyceten-Befall (Pfeile); B) Chromatogramme der DNA-Sequenzen, die unter Verwendung von Primern des EPPO Standards PM 7/129 erzielt wurden; C) Alignments von Primern LCO1490 und HCO2198 mit komplementären Regionen im COI-Gen von ALB und Pythium; SNPs sind farbig dargestellt.

Die Verwendung der Primer LCO1490 und HCO2198 des EPPO Standards PM 7/129 resultiert sehr häufig in unsauberen Chromatogrammen mit uneindeutigen DNA-Sequenzen, wenn ALB-Nagespäne als Ausgangsmaterial verwendet werden. Das Abgleichen (Blasten) der in Abbildung 5B gezeigten unsauberen Sequenz gegen Nukleotid-Datenbanken (bspw. Genbank) lieferte Pythium spp. (Oomycota) als besten „Hit“ (Datenbanktreffer). Sequenz-Vergleiche (Alignments) der Primer LCO1490 und HCO2198 mit komplementären Regionen im COI-Gen zeigen, dass die Primer des EPPO Standards PM 7/129 an ALB und Pythium-Sequenzen gleich gut (bzw. gleich schlecht) binden, da es in beiden Organismen dieselbe Anzahl an unstimmigen Nukleotiden (sogenannten SNPs) zu den Primern gibt. Will man ALB aus solch einer amplifizierten Misch-DNA zuverlässig nachweisen, muss die DNA von ALB aus dem Gemisch aufwendig isoliert werden (z. B. durch Klonierung), oder es müssen alle enthaltenen Organismen sequenziert werden (z. B. durch „Next Generation Sequencing, NGS“) (Abbildung 1). Beide Methoden sind jedoch zu aufwendig und vergleichsweise teuer.

4.2 Welche Ergebnisse sprechen dafür, dass unser Ansatz die Diagnose von ALB aus Nagespänen und Fraß ermöglicht?

Vergleichende Analysen mit Anoplophora chinensis (Citrusbockkäfer, kurz CLB; eng mit ALB verwandte Art) und anderen Insekten belegen, dass unser Protokoll hochspezifisch für den Nachweis des ALB ist. Der Vergleich von ALB-Nagespänen und Kontrollen sollte in etwa das in Abbildung 6 dargestellte Ergebnis liefern: gBlocks (synthetische Nukleotide) der ALB-Zielsequenz werden schon in frühen qPCR-Zyklen (links im Diagramm) nachgewiesen, Positivkontrollen aus Larven-DNA etwas später (weiter rechts im Diagramm) und Negativkontrollen gar nicht (Abbildung 6D). ALB-DNA aus Nagespänen ist gemäß dem Anteil enthaltener, noch nicht degradierter Kopien des Ziel-Gens entweder schon kurz nach den ALB-Positivkontrollen oder entsprechend später nachweisbar (Abbildung 6E). Natürlich kann nicht ausgeschlossen werden, dass die DNA in sehr alten Nagespänen so weit degradiert ist, dass überhaupt keine intakte Kopie der Ziel-Region mehr vorliegt.

Abbildung 6: Abwiegen genau definierter Mengen des Ausgangsmaterials (A), Verdünnungsreihen des Ausgangsmaterials zur Bestimmung der Nachweisgrenze (B); der qTOWER von Analytik Jena, einer von mehreren geeigneten qPCR-Thermocyclern (C); DNA-Amplifizierungs-Plot von ALB-Positiv- und Negativkontrollen (D); DNA-Amplifizierungs-Plot von ALB-DNA aus Nagespänen (E)

Durch Verwendung genau definierter Mengen unterschiedlichen Ausgangsmaterials und Verdünnungsreihen bis jenseits der Nachweisgrenze konnten wir zeigen, dass die von uns entwickelten Primer und Sonden einen zuverlässigen, hochsensitiven und spezifischen Nachweis von ALB aus Nagespänen ermöglichen.