Читать книгу Wirusologia roślinna - Selim Kryczyński - Страница 12

Poliaminy, lipidy, jony metali i woda pełnią w strukturze i funkcjonowaniu cząstek wirusów szczególne role. Podstawowymi składnikami tych cząstek są jednak kwasy nukleinowe i białka. Omówienie funkcji kwasów nukleinowych wymaga pewnego komentarza terminologicznego. Ucząc się genetyki, a zwłaszcza genetyki molekularnej, przyzwyczajamy się do postrzegania funkcji kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) jako genomu, podczas gdy funkcje kwasu rybonukleinowego (RNA) widzimy jako funkcje pośrednika przenoszącego informacje genetyczne zawarte w DNA na białko w procesie translacji (informacyjny RNA, mRNA) czy też funkcje dostarczyciela surowców (aminokwasów) do budowy polipeptydów w polisomach (transportujący RNA, tRNA). Dlatego też, myśląc o odcinkach DNA kodujących określone białka chętnie mówimy geny, natomiast o cząsteczkach RNA powstałych z transkrypcji określonych genów i ulegających swobodnej translacji do określonych białek mówimy raczej otwarte ramki odczytu (ang. open reading frame, ORF). Tymczasem genom wirusa może stanowić RNA, a więc odcinek RNA może być genem, a zarazem otwartą ramką odczytu. Najkrócej mówiąc, w literaturze wirusologicznej oba te pojęcia bywają używane zamiennie i bez rozróżnień; nie ma chyba innego wyjścia, ponieważ pewne fragmenty genomu różnych wirusów ulegają bezpośrednio translacji do odpowiednich białek, bez pośrednictwa mRNA, inne zaś ulegają najpierw transkrypcji do subgenomowego RNA (sgRNA), który jest dopiero właściwą otwartą ramką odczytu i przenosi informację o budowie odpowiedniego białka, pełniąc funkcje informacyjnego mRNA. Najliczniej wśród wirusów roślin są reprezentowane wirusy, których genomem jest pojedyncza, sensowna (plusowa) nić RNA – (+)ssRNA, od anglojęzycznego określenia single stranded RNA. Nić sensowna, to znaczy taka, która może być wykorzystana jako informacyjny RNA (mRNA) w procesie translacji, czyli inaczej mówiąc, może być przetłumaczona bezpośrednio na odpowiednie białko. Jeszcze inaczej mówiąc, jest to kwas rybonukleinowy, którego początkiem jest koniec 5' nici (ryboza ma wolny, niepołączony z resztą kwasu ortofosforowego węgiel w pozycji 5'), a zakończeniem jest koniec 3' nici (ryboza, która ma wolny, niepołączony z resztą kwasu ortofosforowego węgiel w pozycji 3'). Zgodnie z jedną z reguł procesu translacji, proces ten postępuje zawsze od końca 5' w kierunku końca 3', a zgodnie z europejską tradycją zapisu mowy, zdania, a więc i kod genetyczny zapisujemy od strony lewej ku stronie prawej (Berg i Singer, 1997). Pierwszą trójką (triplet, kodon) nukleotydów jest kodon początkujący (kodon startowy) AUG kodujący równocześnie metioninę jako aminokwas montowany w łańcuchu polipeptydowym. Jedna z trzech możliwych trójek nukleotydów – UAG, UAA lub UGA stanowi kodon kończący, czyli tzw. kodon stop. Kodony stop nie kodują żadnych aminokwasów, lecz stanowią wyłącznie sygnał zakończenia translacji otwartej ramki odczytu do określonego polipeptydu. Liczba i sekwencja nukleotydów, a właściwie ich trójek w ssRNA, stanowią o tożsamości każdego wirusa i są wobec tego względnie stałe. Genomy wirusów roślin są stosunkowo niewielkie i liczą sobie z reguły od 10⁴ do 10⁵ nukleotydów, zaś genomy np. zwierząt mają od 10⁹ do 10¹⁰ par nukleotydów, a genomy roślin są jeszcze większe i liczą od 10¹⁰ do 10¹¹ par nukleotydów. Zgodnie z powszechnie przyjętą terminologią liczbę nukleotydów podaje się na ogół w tysiącach (przedrostek kilo-) i wyraża się ją jako liczbę wbudowanych zasad purynowych lub pirymidynowych (ang. kilobase, kb) lub par tych zasad (ang. kilobase pairs, kbp) Typowa masa genomu wirusa roślinnego mieści się w granicach od 4,0 × 10⁵ do 4,6 × 10⁶ daltonów (dalton [Da] jest to bezwzględna masa jednego atomu wodoru). Masa pojedynczego nukleotydu wynosi około 330 Da, z czego wynika, że masa 1 kb wynosi około 330 kDa.

Oczywiście, nie jest tak, że wszystkie cząsteczki kwasu nukleinowego określonego gatunku wirusa są całkowicie identyczne. Po pierwsze, wśród wirusów jest wiele takich, których kompletny genom jest zapisany na paru (2–4) różnych cząsteczkach RNA (prawie 20% spośród wszystkich rodzajów wirusów roślin uznanych oficjalnie przez ICTV). Poszczególne fragmenty genomu tych wirusów o wielosegmentowym genomie różnią się od siebie wielkością i sekwencją nukleotydów, i wreszcie treścią zapisu genetycznego (zob. podrozdz. 3.2). Ale i w przypadku wirusów o jednosegmentowym genomie lub w przypadku tego samego segmentu genomu wirusa o wielosegmentowym genomie, poszczególne cząsteczki kwasu nukleinowego nie są identyczne z powodu ciągle zdarzających się błędów w replikacji tego kwasu. Zagadnienia te zostaną szczegółowo przedstawione w podrozdziale 3.4 omawiającym zmienność wirusów. Różnice w wynikach pomiarów dotyczących wielkości i sekwencji ssRNA wirusowego mogą być rezultatem innych jeszcze zdarzeń:

• RNA może ulec uszkodzeniu w trakcie izolowania go z materiału roślinnego,

• RNA wirusowy ulega czasem samorzutnej częściowej degradacji w komórkach roślin w nienaruszonych cząstkach wirusa,

• opłaszczeniu białkiem może ulec niepełna kopia RNA wirusa, np. jego subgenomowy fragment (Palukaitis, 1984),

• opłaszczeniu białkiem wirusa może ulec któryś z RNA żywiciela i cząstki takie mogą być mylnie poczytane za cząstki wirusa – dane takie uzyskano w badaniach nad wirusami z rodzaju Tymovirus, w których cząstkach znaleziono prawdopodobnie tRNA roślinny (Bouley i in., 1976) i Tobamovirus (Siegel, 1971),

• w badanym preparacie może być obecny RNA wirusa satelitarnego, niestanowiący genomu badanego wirusa,

• w trakcie replikacji RNA powstają czasem jego ułomne formy (rozdz. 3), które mogą być obecne w preparacie,

• rozbieżności w pomiarach mogą być wynikiem tworzenia przez RNA w roztworze drugorzędowych, a nawet trzeciorzędowych struktur; powstają w ten sposób różne konformacyjnie cząsteczki RNA, które mogą ulec rozdzieleniu w toku dostatecznie precyzyjnej elektroforezy lub np. wirowania w gradiencie gęstości (Dickerson i Trim, 1978),

• w pewnych warunkach RNA wirusowy może tworzyć dimery (Asselin i Zaitlin, 1978).

Dość ważną cechą RNA, w tym również RNA wirusów roślin, jest absorpcja promieniowania UV w zakresie od 230 do 290 nm. Skład RNA wirusów roślin, a zwłaszcza proporcje nukleotydów zawierających zasady purynowe i pirymidynowe decyduje o tym, że maksimum absorpcji (wierzchołek krzywej absorpcji) leży zazwyczaj w okolicy 260 nm. Pomiar absorpcji promieni UV tej właśnie długości bywa używany nawet do oznaczania zawartości wirusa w przygotowywanych preparatach (Noordam, 1973). Na przykład A260 dla 1 mg/ml RNA wirusa mozaiki tytoniu w roztworze fizjologicznym wynosi około 29, a dla RNA wirusa żółtej mozaiki rzepy w tych samych warunkach około 23 (Matthews, 1991).

Przestrzenne ułożenie (konformacja) RNA w cząstce wirusa zależy głównie od jego powiązań z białkiem wirusa. Wolny RNA wirusowy, uwolniony z okrywy białkowej nie przybiera, jak można by się spodziewać, struktury liniowej, tzn. nić RNA nie rozciąga się swobodnie na całą długość. W normalnych warunkach (temperatura pokojowa, pH około 7,0 i molowość roztworu odpowiadająca 0,1 M NaCl) na nici RNA występują liczne, krótkie odcinki helikalne przedzielone odcinkami rozwiniętej pojedynczej nici RNA, co nadaje cząsteczce kwasu nukleinowego dość zwartą strukturę. Liczba i długość tych sparowanych (połączonych w pary) odcinków zależy, oczywiście, od składu nukleotydowego RNA, a konkretnie od liczby i długości komplementarnych odcinków mogących ulec sparowaniu. Zależy to jednak również od warunków zewnętrznych, a przede wszystkim od temperatury, pH roztworu i zawartości kationów. Całkowita lub częściowa denaturacja może nastąpić w wyniku zmiany tych warunków. Warto zauważyć, że zmienia to również fizyczne właściwości RNA, np. absorpcję UV. Należy to brać pod uwagę przy oznaczaniu właściwości fizycznych RNA wirusa (Ehresmann i in., 1987).

Poszczególne rodzaje kwasów nukleinowych różnią się między sobą znacząco cechą, która nazywa się gęstością pławalną (ang. buoyant density) w roztworach soli cezu. Kiedy stężone roztwory chlorku lub siarczanu(VI) cezu poddaje się wirowaniu w odpowiednich warunkach, ciężkie jony cezu tworzą gradient gęstości. Jeśli w roztworze takim znajdzie się kwas nukleinowy, lokalizuje się on po wirowaniu w postaci prążka w tej warstwie gradientu, która odpowiada gęstością gęstości tego kwasu. RNA osadza się na dnie gradientu CsCl, a np. dwuniciowy DNA zatrzymuje się tam w postaci prążka w pozycji odpowiadającej gęstości pławalnej równej około 1,69–1,71 g/cm³. Gęstość pławalna DNA oznaczona w gradiencie chlorku cezu zależy od zawartości nukleotydów G+C i, dzięki temu, wirowanie w gradiencie gęstości może być użyte w celu określenia składu nukleotydowego takiego DNA. Gęstość pławalną różnych rodzajów kwasów nukleinowych w gradiencie gęstości Cs2SO4 podano w tabeli 1.

Tabela 1. Gęstość pławalna różnych rodzajów kwasów nukleinowych wyznaczona przez wirowanie w gradiencie gęstości siarczanu(VI) cezu 1,56 g/cm3 (wg Matthewsa, 1991)

Rodzaj kwasu nukleinowego	Gęstość pławalna w g/cm3
dsDNA	1,42–1,44
ssDNA	1,49
dsRNA	1,60
ssRNA	1,65

U pewnych wirusów zostały zidentyfikowane charakterystyczne struktury zakończeń nici RNA. Jedną z takich struktur jest tzw. czapeczka (ang. cap) występująca na końcu 5' u wirusów z rodzajów Alfamovirus, Bromovirus, Cucumovirus, Carmovirus, Furovirus, Hordeivirus, Potexvirus, Tobamovirus, Tobravirus i Tymovirus. Jest to struktura charakterystyczna dla informacyjnego RNA występującego w komórkach ssaków oraz u wirusów zwierząt (siedem kolejnych nukleozydów guaninowych związanych z nicią RNA trzema kolejnymi resztami kwasu ortofosforowego; ryboza w ostatnim nukleozydzie jest podstawiona grupą metylową w pozycji 5'). U innych wirusów roślin z końcem 5' nici RNA jest związane tzw. białko VPg (ang. virus protein genome linked). Są to białka o stosunkowo małej masie cząsteczkowej (3500–24000) kodowane przez fragment genomu wirusa, u którego występują. Gen kodujący VPg został u niektórych wirusów rozpoznany – np. u wirusa mozaiki wspięgi należącego do rodzaju Comovirus (Jaegle i in., 1987). Białka takie poznano również u wirusów należących do rodzajów Luteovirus, Nepovirus, Potyvirus i Sobemovirus (Daubert i Bruening, 1984). Wirusy o podzielonych (segmentowych) genomach mają te same białka VPg na końcach 5' wszystkich fragmentów genomu.

Z kolei, na końcu 3' RNA niektórych wirusów roślin występują długie łańcuchy poliadeninowe – tzw. łańcuchy poli(A) charakterystyczne dla informacyjnych RNA (mRNA) z komórek organizmów eukariotycznych. Łańcuchy te mogą się składać z 25 nawet do 370 kolejnych adenonukleotydów (Ahlquist i Kaesberg, 1979). Struktury takie zostały zidentyfikowane u wirusów roślin, których RNA funkcjonuje jako mRNA, np. u wirusów należących do rodzajów Capillovirus, Comovirus, Furovirus, Nepovirus, Potexvirus i Potyvirus. Inną formą końca 3' łańcucha (+)ssRNA wirusowego jest koniec wykazujący aktywność podobną do aktywności tRNA, tzn. wiążący aminokwasy, a wykryty najpierw u wirusów z rodzaju Tymovirus (Pinck i in., 1975). Analogiczną strukturę końca 3' RNA wykryto też u wirusów z rodzaju Cucumovirus (Kohl i Hall, 1974), Bromovirus i Hordeivirus (Loesch-Fries i Hall, 1982) oraz Tobamovirus (Garcia-Arenal, 1988). Model pierwszoi drugorzędowej struktury końca 3' RNA wirusa żółtej mozaiki rzepy zaproponowali Dumas i inni, 1987. Jest to tzw. nibywęzeł (ang. pseudoknot), którego istotną częścią są sekwencje trzech par zasad GC w pętlach oraz kolejna trójka nukleotydów cytydynowych w jednoniciowej części struktury między pętlami.

W efekcie powstaje końcowe ramię złożone z 12 par nukleotydów identycznych jak w klasycznym tRNA (ryc. 4) zdolne do specyficznego wiązania aminokwasów.

Inną formą genomu u wirusów roślin jest dwuniciowy RNA (dsRNA). U wirusów z rodzaju Reovirus składa się on z 10 do 12 segmentów dsRNA (Hibi i in., 1984), a u zbadanych pod tym względem wirusów z rodzaju Alphacryptovirus zidentyfikowano tylko dwa takie segmenty (Accotto i Boccardo, 1986). Masa genomu sięga 16–19 × 10⁶ daltonów. Tego rodzaju struktura zapewnia odporność na RNazę (rybonukleazę). Denaturacja zachodzi albo w środowisku o słabej sile jonowej, albo w środowisku o ekstremalnie niskich lub wysokich wartościach pH, albo pod wpływem temperatury. Krzywa denaturacji termicznej jest dość stroma. Denaturacja dsRNA wirusa karłowatości ryżu zaczyna się np. przy temperaturze około 70°C, a pełna denaturacja następuje już w warunkach temperatury 80°C (Miura i in., 1966).

Ryc. 4. Podobieństwa końcowej części RNA wirusa żółtej mozaiki rzepy (A, B) i klasycznego tRNA z drożdży (C, D) (wg P. Dumas i in., 1987): A, C – drugorzędowa struktura końcowego fragmentu RNA; B, D – modele przestrzenne struktury obu RNA

Pierwszym wirusem roślinnym, u którego stwierdzono genom inny niż ssRNA, był wirus mozaiki kalafiora; jego genom to dwuniciowy dsDNA (Shepherd i in., 1968, 1970). Obecnie wiadomo, że taki właśnie genom mają wszystkie wirusy z rodziny Caulimoviridae. Podwójna nić DNA tworzy zazwyczaj kolistą, otwartą strukturę, choć często konformacja tego DNA bywa bardziej złożona przez dodatkowe skręcanie się i tworzenie węzłów. Nić α, czyli nić minusowa, jest otwarta w jednym miejscu, natomiast w nici plusowej (kodującej) występują dwie przerwy. Powstałe w ten sposób trzy nici DNA są nazywane kolejnymi literami alfabetu greckiego – β, γ i δ. Nić α jest taka sama u wszystkich caulimowirusów, natomiast różne gatunki i szczepy wirusów z tej rodziny różnią się pozycjami, w których występują przerwy w drugiej nici, a zatem długością nici β, γ i δ. Z końcem 5' poszczególnych nici DNA tworzących genom caulimowirusów są związane często pojedyncze nukleotydy lub krótkie łańcuchy nukleotydów będących składnikami RNA. Uważa się, że grają one pewną rolę w inicjacji replikacji DNA caulimowirusów (Guilley i in., 1983).

Genom w postaci jednoniciowego ssDNA mają wirusy z rodziny Geminiviridae. Pierwszych informacji na ten temat dostarczyły prace Goodmana (1977a, b) oraz Harrisona i innych (1977). Opisywane wcześniej u niektórych geminiwirusów podwójne nici DNA lub podwojone formy ssDNA (zob. Matthews, 1991) są zapewne formami replikacyjnymi tych wirusów (Lazarowitz, 1988).

Wszystkie opisane dotychczas formy kwasów nukleinowych tworzących genomy różnych wirusów roślin mają tę wspólną właściwość, że są infekcyjne, podobnie jak pełne wiriony. Oznacza to, że taki kwas nukleinowy, wyizolowany z cząstki wirusa, może być wprowadzony do komórki roślinnej i będzie tam się namnażał. Inaczej pod tym względem zachowują się jednoniciowe RNA stanowiące genomy wirusów roślin zaliczanych do rodzin Rhabdoviridae (rodzaje Cytorhabdovirus i Nucleorhabdovirus) i Bunyaviridae (rodzaj Tospovirus). Są to jednoniciowe RNA, ale o antysensownej orientacji (–)ssRNA – od końca 3' do końca 5' (wolny, niepołączony z resztą kwasu ortofosforowego pozostaje węgiel w pierścieniu, w pozycji 3'). Ze względu na tę antysensowną orientację te kwasy nukleinowe nie mogą ulegać translacji w komórkach roślin i wobec tego nie namnażają się, kiedy są wprowadzone do tych komórek samodzielnie, po wyizolowaniu z cząstek wirusa. W pełnych cząstkach tych wirusów zawarta jest gotowa już polimeraza RNA, co umożliwia syntezę sensownej, zdolnej do translacji nici RNA, co z kolei zapoczątkowuje proces namnażania takiego wirusa w komórce roślinnej.

Oczywiście, od momentu poznania natury genomu wirusa i natury kodu genetycznego interesowano się sekwencją nukleotydów w kwasach nukleinowych wirusów. Początkowo, ze względu na trudności metodyczne, ograniczono się do oznaczania sekwencji końców 5' i 3' jako ważnych funkcjonalnie (zob. Matthews, 1991). Pierwszym wirusem rośliny, u którego rozpoznano pełną sekwencję DNA, był wirus mozaiki kalafiora (Franck i in., 1980). Dopiero opanowanie techniki tworzenia bibliotek cDNA (sekwencji kwasu deoksyrybonukleinowego komplementarnych do określonego RNA) pozwoliło na uzyskanie pełnej sekwencji nukleotydów w genomie wirusa mającego RNA. Oczywiście, był to wirus mozaiki tytoniu (Goelet i in., 1982). Warto zaznaczyć, że wcześniej była poznana sekwencja nukleotydów w RNA wiroida wrzecionowatości bulw ziemniaka (Gross i in., 1978). Lata 80. i 90. XX wieku to okres, w którym szybko przybywało danych o sekwencjach genomów poszczególnych wirusów roślin. Zawdzięczamy to gwałtownemu postępowi w rozwoju technik sekwencjonowania kwasów nukleinowych (Ausubel i in., 1987, 1988). Równocześnie upowszechniało się stosowanie komputerów zarówno jako narzędzi badawczych, jak i środków łączności (Internet) oraz gromadzenia i wymiany informacji. Aktualnie istnieje kilka baz danych, w których można znaleźć dane o sekwencji nukleotydów w kwasach nukleinowych poznanych pod tym względem wirusów roślin. Baza danych ICTV (ICTVdB) jest dostępna na niżej podanych stronach internetowych:

http://life.anu.edu.au/viruses/welcome.htm (Grupa Bioinformatyczna Australian National University, Canberra);

http://www.ncbi.ncm.nlm.nih.gov/ICTVdB/welcome.htm (NCBI Bethesda, USDA);

http://www.res.bbsrc.ac.uk/mirror/auz/welcome.htm (IACR, Rothamsted, UK).

Podstawowa baza danych o wirusach roślin (Virus Identifiction Data Exchange – VIDE database) jest dostępna na stronie http://biology.anu.edu.au.

Olbrzymią rolę w poznaniu sekwencji kwasów nukleinowych odegrały enzymy restrykcyjne albo tzw. endonukleazy restrykcyjne. Uzyskiwane są one z komórek różnych bakterii lub innych organizmów prokariotycznych i służą do rozcinania (hydroliza wiązań fosfodiestrowych) długich sekwencji kwasów nukleinowych w ściśle określonych miejscach. Uzyskane fragmenty kwasów nukleinowych (około 1 kbp), tzw. fragmenty restrykcyjne można poddawać elektroforezie na żelach poliakryloamidowych albo, jeśli są dłuższe (około 20 kbp), na żelach agarozowych o większych porach. Po rozdzieleniu tych fragmentów można je albo barwić bezpośrednio (zob. rozdz. 9), albo, po zdenaturowaniu w celu uzyskania łańcucha jednoniciowego, wykonuje się ich odcisk na błonie nitrocelulozowej (filtr nitrocelulozowy). Po hybrydyzacji z odpowiednią sondą molekularną (zob. rozdz. 9) znakowaną izotopem ³²P wykonuje się autoradiogram, na którym prążki są bardzo dobrze widoczne. Można, dzięki temu, zlokalizować konkretny, poszukiwany fragment DNA. Metoda ta została opracowana przez E.M. Southerna i nazywa się Southern blotting. Opracowana nieco później analogiczna technika poszukiwania fragmentów restrykcyjnych RNA została, dla kontrastu, nazwana Northern blotting.

Mutacje zachodzące w obrębie miejsc restrykcyjnych, to znaczy miejsc cięcia łańcuchów kwasu nukleinowego przez enzymy restrykcyjne, powodują zmiany w długości fragmentów restrykcyjnych, czyli tzw. polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (ang. restriction fragments length polymorphism, RFLP). Elektroforetyczna analiza fragmentów restrykcyjnych z użyciem wzorców o znanych, standardowych długościach może dostarczyć informacji o tej zmienności.

W 1984 roku Kary Mullis opisał i opatentował (zob. rozdz. 9) metodę wielokrotnego powielania określonych odcinków DNA, czyli amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR), najlepiej chyba objaśnioną przez Saiki i innych (1988). Jeśli chcemy powielać pewien konkretny fragment DNA, musimy znać flankujące ten fragment sekwencje (około 20 nukleotydów) sąsiadujących z nim fragmentów tego kwasu. Trzeba wyprodukować odcinki starterowe (tzw. primery) DNA o sekwencjach komplementarnych do tych sekwencji flankujących. Pierwszym etapem reakcji jest denaturacja termiczna (95°C) wyjściowej cząsteczki DNA pozwalająca uzyskać formę jednoniciową. W drugim etapie (ang. annealing) primery są przyłączane przez hybrydyzację do komplementarnych sekwencji flankujących fragment, który chcemy powielać. Ten etap reakcji przebiega w temperaturze 54°C. Trzeci, zasadniczy etap, to synteza DNA z obecnych w środowisku reakcji trifosforanów wszystkich czterech deoksyrybonukleozydów (dNTP) prowadzona w dość wysokiej temperaturze (72°C) przez polimerazę Taq. Jest to polimeraza DNA pochodząca z termofilnych bakterii Thermus aquaticus żyjących w gorących źródłach. Obie sekwencje starterowe wydłużają się w kierunku sekwencji docelowej. W ten sposób uzyskuje się kopie obu nici naszej docelowej sekwencji DNA. W kolejnym cyklu mogą już służyć one za matryce. W ten sposób liczebność tych matryc zwiększa się wykładniczo z cyklu na cykl i dzięki temu bardzo szybko uzyskujemy bardzo dużą liczbę kopii (10⁶ w czasie 30 cykli, czyli około 120–150 min) interesującego nas fragmentu DNA. Istotą metody jest zastosowanie aparatu (termocykler) szybko zmieniającego temperaturę oraz użycie polimerazy zdolnej do funkcjonowania w podwyższonej temperaturze.

Większość wirusów roślin ma genom w postaci RNA, którego nie da się zamplifikować w ten sposób. Wystarczy jednak używając odwrotnej transkryptazy uzyskać komplementarny DNA, który można już amplifikować. Metoda ta nazywa się RT-PCR (ang. reverse transcription-polymerase chain reaction). Amplifikacja kwasów nukleinowych metodą PCR lub RT-PCR dostarcza dużej ilości materiału do wszelkiego rodzaju badań (sekwencjonowanie, porównywanie różnych wariantów wirusów, wykrywanie wirusów przy zbyt małej ilości wyjściowej w materiale roślinnym). Dość szczególną metodą jest metoda RAPD (ang. random amplified polymorphic DNA). Stosuje się tu pojedyncze, losowo wybrane startery (primery), które przyłączają się do powtarzających się, komplementarnych sekwencji w niciach DNA. Po amplifikacji uzyskujemy więc fragmenty, których długość odpowiada odległości między sekwencjami komplementarnymi do primerów. Długość tych fragmentów odczytuje się po analizie elektroforetycznej i porównaniu ze standardami.