Читать книгу Wirusologia roślinna - Selim Kryczyński - Страница 13

Białka występujące w cząstkach wirusów są pod względem składu aminokwasowego identyczne z białkami występującymi w żywych organizmach. W ich skład wchodzą cząsteczki 20 pospolitych aminokwasów, przy czym stosunkowo rzadko występują cysteina, histydyna, metionina, tryptofan i tyrozyna. Aminokwasy te tworzą strukturalne podjednostki białkowe liczące po paręset cząsteczek aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Cały kapsyd składa się z kilkuset (u niektórych wirusów izometrycznych) do kilku tysięcy (u niektórych wirusów wydłużonych) takich podjednostek. Umożliwia to upakowanie całego genomu wirusa, którego stosunkowo niewielka pojemność informacyjna nie pozwala na kodowanie większych białek. Kodowana jest tylko sekwencja aminokwasów w pojedynczej podjednostce. U znakomitej większości wirusów roślin, to znaczy prawie u wszystkich wirusów roślin o genomie typu (+)ssRNA, występuje tylko jeden rodzaj takich podjednostek i wszystkie podjednostki białka wirusa są identyczne. Wyjątkiem są wirusy z rodzaju Comovirus, u których występują dwa rodzaje podjednostek. Wirusy z rodzin Caulimoviridae i Reoviridae, a także wirusy roślin mające dodatkową otoczkę lipoproteinową mają po kilka różnych białek, w tym przynajmniej jedno jest białkiem enzymatycznym. Często używa się określeń białka strukturalne i białka niestrukturalne. Te pierwsze stanowią składniki budulcowe cząstek wirusów i są w wirionach obecne w stanie ich spoczynku, te drugie zaś pełnią różne funkcje związane, na przykład, z namnażaniem lub transportem wirusów w roślinach i pojawiają się tylko w toku realizowania tych funkcji.

Różne metody izolowania białka wirusowego z zakażonego materiału roślinnego albo z czystych już preparatów wirusa mogą doprowadzić do uzyskania tego białka w różnych postaciach. Czasami, zwłaszcza w przypadkach wirusów tworzących w komórkach roślin dużą liczbę pustych kapsydów (ang. viral protein shell) można uzyskać pełne okrywy białkowe. Preparaty takie uzyskuje się łatwo w przypadku, na przykład, wirusa żółtej mozaiki rzepy (Turnip yellow mosaic virus, TYMV). Częściej jednak uzyskuje się preparaty podjednostek białkowych albo pojedynczych, albo w różnym stopniu zagregowanych. Są one połączone ze sobą wiązaniami kowalencyjnymi, ale nie mostkami siarkowymi charakterystycznymi dla dwusiarczków (wiązanie przez grupy tiolowe –SH). Tworzenie mostków siarkowych, najczęściej między cząsteczkami cysteiny, prowadzi do powstawania nieodwracalnie zdenaturowanych agregatów białkowych (zob. Matthews, 1991). Zastosowanie fenolu do izolowania białka doprowadza na ogół do denaturacji tego białka. Można je jednak zrenaturować przez wytrącenie metanolem i podgrzanie do 60°C przy pH 7,0–7,5.

Obok białek kapsydu w cząstkach niektórych wirusów wykryto także inne białka, przede wszystkim funkcjonujące w procesie replikacji genomu wirusa. U wirusa mozaiki kalafiora rozpoznano polimerazę DNA zależną od DNA (Ménissier i in., 1984), a u innych wirusów polimerazę RNA zależną od RNA – np. u wirusów roślin z rodziny Reoviridae (Uyeda i in., 1987) i Rhabdoviridae (Francki i Randles, 1972; Toriyama i Peters, 1981) oraz u wirusów z rodzajów Tospovirus (de Haan i in., 1991), Tenuivirus (Toriyama, 1986) i Alphacryptovirus (Marzachi i in., 1988).

Tabela 2. Podstawowe aminokwasy, ich oznaczenia i kodujące je trójki nukleotydów

Aminokwas	Symbol 3*	Symbol 1**	Kodujące trójki nukleotydów
Alanina	Ala	A	GCU GCC GCA GCG
Arginina	Arg	R	CGU CGC CGA CGG
Asparagina	Asn	N	AAU AAC
Kwas asparaginowy	Asp	D	GAU GAC
Cysteina	Cys	C	UGU UGC
Fenyloalanina	Phe	F	UUU UUC
Glicyna	Gly	G	GGU GGC GGA GGG
Glutamina	Gln	Q	CAA CAG
Kwas glutaminowy	Glu	E	GAA GAG
Histydyna	His	H	CAU CAC
Izoleucyna	Ile	I	AUU AUC AUA
Leucyna	Leu	L	CUU CUC CUA CUG
Lizyna	Lys	K	AAA AAG
Metionina	Met	M	AUG
Prolina	Pro	P	CGU CCC CCA CCG
Seryna	Ser	S	UCU UCC UCA UCG
Treonina	Thr	T	ACU ACC ACA ACG
Tryptofan	Trp	W	UGG
Tyrozyna	Tyr	Y	UAU UAC
Walina	Val	V	GUU GUC GUA GUG

* – symbole trzyliterowe; ** – symbole jednoliterowe

Kolejne trójki nukleotydów w genomie wirusa kodują odpowiednie aminokwasy (tab. 2). W ten sposób jest determinowana sekwencja aminokwasów w białkach strukturalnych i w innych białkach syntetyzowanych w czasie cyklu życiowego wirusa. Sekwencja aminokwasów decyduje o najważniejszych właściwościach powstałego białka, w tym również o jego konformacji. Białka podjednostek białkowych kapsydu, w wyniku skomplikowanych procesów fałdowania białka, tworzą bardzo złożone struktury. Z pewnych względów zajmiemy się w tym miejscu strukturą zewnętrznej powierzchni tego białka. Pofałdowania i wystające krótkie łańcuchy aminokwasowe tworzą w podjednostkach białkowych każdego wirusa jedyny i niepowtarzalny wzór. Poszczególne elementy tego wzoru, czyli tzw. epitopy, są odczytywane przez system immunologiczny ssaka, do którego krwi białko takie zostało wprowadzone. System ten, jako system obronny, odpowiada wytworzeniem specyficznych przeciwciał (ang. antibodies), które zawsze rozpoznają antygen (w tym przypadku białko podjednostek kapsydu wirusa) wywołujący ich produkcję i zawsze starają się go zneutralizować. Właściwość ta została wykorzystana w immunologicznych (serologicznych) metodach badania wirusów (Van Regenmortel, 1982). Przeciwciała (immunogammaglobuliny, IgG) są również białkami, a konkretnie niewielkimi białkami z grupy gammaglobulin o charakterystycznej budowie (ryc. 5). Pojedyncza gammaglobulina przypomina literę Y. Składają się na nią dwa polipeptydy połączone mostkami siarkowymi z grup tiolowych. Podstawa (trzonek) jest nazywana fragmentem Fc i nie jest istotna dla specyficznej reakcji przeciwciał z antygenem. Dwa jej ramiona, nazywane fragmentem Fab, odgrywają zasadniczą rolę, wiążąc się specyficznie z antygenem, przeciwko któremu zostały wytworzone. Każde z tych ramion tworzące tzw. ciężki łańcuch peptydowy, jest połączone mostkiem siarkowym z mniejszym (łańcuch lekki) polipeptydem i to w sumie tworzy istotny dla reakcji serologicznej fragment Fab. Ponieważ fragment Fc nie odgrywa żadnej roli, w różnych procedurach serologicznych używa się spreparowanych przeciwciał trawionych papainą, która oddziela aktywną część Fab. Trawienie pepsyną powoduje, że uzyskuje się nieco większy fragment określany jako F(ab')2 często stosowany aktualnie w różnych badaniach serologicznych.

Bardzo dobrymi producentami przeciwciał są króliki, przy czym w hodowlach zwierząt laboratoryjnych utrzymuje się specjalne rasy królików o sprawdzonej, dobrej odpowiedzi immunologicznej. Króliki są z jednej strony dobrymi producentami przeciwciał, a z drugiej zwierzętami łatwymi w hodowli i w wykorzystaniu, to znaczy szybko się rozmnażają, nie są za duże i nie sprawiają kłopotów ani w samej hodowli, ani w czasie wykonywania zabiegów immunizacji (uczulania) i pobierania krwi. Do produkcji dużej ilości surowic można używać większych zwierząt, mających więcej krwi (np. konie), ale ich utrzymanie jest dużo bardziej kosztowne i kłopotliwe. Do produkcji bardzo małych ilości surowicy (np. przy wytwarzaniu przeciwciał monoklonalnych) używa się drobnych zwierząt laboratoryjnych, np. myszy. Specjalne techniki serologiczne, tzw. techniki pośrednie (zob. podrozdz. 8.4.2) wymagają użycia dwóch rodzajów przeciwciał – pierwsze uczulone na białko wirusowe, drugie uczulone na gammaglobuliny pierwszych przeciwciał. Z reguły producentami tych pierwszych są króliki, a tych drugich – kozy, również zwierzęta mało wymagające, jeśli chodzi o utrzymanie.

Ryc. 5. Elementy budowy gammaglobuliny przeciwciała

Immunizacji (uczulenia na antygen) królika dokonujemy, wstrzykując mu dożylnie (do zewnętrznej, brzeżnej żyły w uchu) porcję 1–2 ml oczyszczonego antygenu w fizjologicznym roztworze soli. Wirus pełniący rolę antygenu musi być bardzo dobrze oczyszczony. Obecność innego białka spowoduje wytworzenie przeciwciał na to białko i, w konsekwencji, złą jakość surowicy. Można antygen wstrzykiwać również domięśniowo, ale wówczas na ogół dodaje się (1:1) tzw. adiuwant Freunda (olej parafinowy zawierający mannidooleinian) do preparatu wirusa. Zastrzyki trzeba powtarzać (2–3 zastrzyki co 3–4 dni). Układ limfatyczny królika wytwarza przeciwciała, które są uwalniane do krwiobiegu. Maksymalny poziom zawartości przeciwciał we krwi zwierzęcia uzyskuje się z reguły po 2–3 tygodniach. Pobieramy wówczas krew i przetrzymujemy ją przez kilka godzin w warunkach temperatury pokojowej w celu skoagulowania krwinek. Następnie krew odwirowujemy (np. 15–20 min przy 5–10 tys. obr./min), strącając w ten sposób skoagulowane krwinki. Pozostaje czyste osocze (surowica, serum) z zawiesiną przeciwciał. Ponieważ surowica ta zawiera przeciwciała specyficzne w stosunku do wprowadzonego do krwi zwierzęcia antygenu, nazywamy ją surowicą uczuloną na dany antygen albo antysurowicą (antyserum) przeciw temu antygenowi. Podstawową cechą surowicy jest zawartość w niej specyficznych przeciwciał. Liczbę tych przeciwciał można wyrazić, określając miano surowicy. Jest to największe rozcieńczenie w szeregu dwójkowym (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 … itd.), które reaguje w widoczny sposób z wirusem np. w reakcji mikroprecypitacji (podrozdz. 8.4.2). Surowicę taką można, zwłaszcza po dodaniu azydku sodu (0,01%), przechowywać bezpiecznie w zatopionych ampułkach. Można ją też zliofilizować, co znakomicie wydłuża czas bezpiecznego przechowywania. W tej postaci surowice uczulone na różne wirusy są produkowane i sprzedawane przez specjalistyczne laboratoria. Reakcje serologiczne, to znaczy reakcje przeciwciał ze specyficznym dla nich antygenem, są przeprowadzane w różny sposób i na różnych podłożach. Różny jest też sposób obserwowania tych reakcji, albo bezpośrednio, albo dzięki znakowaniu surowicy różnymi metodami. Te różne sposoby nazywane są różnymi technikami serologicznymi. Niektóre z nich zostaną opisane w podrozdziale 8.4.2, inne są omówione w wielu podręcznikach i innych opracowaniach (van Regenmortel, 1982; Matthews, 1991).