Читать книгу Wirusologia roślinna - Selim Kryczyński - Страница 9

Wirusy roślin bytują wewnątrz komórek roślinnych i zanim zaczniemy pracę zmierzającą w kierunku poznania wirusa znalezionego w jakiejś roślinie, musimy ten wirus z tej rośliny wydostać, to znaczy wyizolować go. Zazwyczaj można to zrobić jednym z dwóch sposobów: 1) rozdrobnić materiał roślinny zawierający wirus (liście, części kwiatów, owoce, a czasem nawet taki materiał jak łyko) do tego stopnia, by uzyskać dość płynną, na oko homogenną pulpę zwaną „sokiem”, która zawiera wirus; konieczne jest oczywiście zniszczenie ścian komórkowych; 2) znaleźć owada czy inny organizm przenoszący ten wirus, czyli tzw. wektora wirusa (zob. podrozdz. 6.6 i 6.7) i stworzyć sytuację, w której organizm ten pobierze wirus. Następnie tym sokiem albo z użyciem wektora trzeba zakazić jakąś odpowiednią roślinę, która będzie służyć do prowadzenia „hodowli” badanego wirusa w laboratorium. W wyjątkowych przypadkach, kiedy wirus nie przenosi się przez sok ani przez jakiegokolwiek wektora, można się uciec do przenoszenia przez szczepienie. Posługiwanie się w czasie badań rośliną stanowiącą oryginalne źródło wirusa i rosnącą w polu, w sadzie, w ogrodzie czy w jakimś stanowisku naturalnym jest niewygodne (odległość) i niewskazane (nie jesteśmy w stanie kontrolować ani warunków wzrostu tej rośliny, ani stanu jej zdrowotności, a może ona też być niewydajnym źródłem wirusa). Wiele informacji na temat postępowania w toku izolowania wirusa, prowadzenia jego kultur oraz późniejszego oczyszczania można znaleźć w opracowaniach pomyślanych jako praktikum wirusologiczne (np. Noordam, 1973; Dijkstra i de Jager, 1998; Kryczyński, 2005b).

Oczywiście, kiedy przystępujemy do badań tego wirusa, nie wiemy o nim prawie nic i nie wiemy, na przykład, jaka roślina będzie odpowiednia do prowadzenia jego hodowli. Często trzeba więc sprawdzić wiele różnych roślin jako potencjalnych żywicieli wirusa. Czasem możemy się posłużyć tym samym gatunkiem, na którym wirus został znaleziony, czasem jakimś gatunkiem pokrewnym. Czasem wybieramy któryś z gatunków znanych jako dobrzy żywiciele licznych wirusów roślin. Do takich roślin należą różne gatunki z rodzin Solanaceae, Cucurbitaceae czy Fabaceae.

Procedury przygotowania soku oraz inokulacji mechanicznej roślin opisano szczegółowo w podrozdziale 6.4. Hodowlę wirusa w laboratorium, a właściwie w szklarni, prowadzi się przez kolejne przenoszenie go mechaniczne lub przez odpowiednie wektory na nowe egzemplarze roślin stanowiących dobrych żywicieli wirusa i dobre jego źródło. Oczywiście, rośliny te muszą mieć zapewnione odpowiednie warunki wzrostu i rozwoju oraz muszą być dobrze zabezpieczone przed niekontrolowanym zakażeniem przez inne wirusy lub inne patogeny. Pasażując wielokrotnie mechanicznie wirus, który w naturze jest przenoszony przez wektory, należy się liczyć z możliwością utraty zdolności przenoszenia go przez te wektory. Przez pewien czas kulturę wirusa można utrzymać w wysuszonym materiale roślinnym umieszczonym w eksykatorze nad chlorkiem wapnia albo w materiale zamrożonym. Najlepszym sposobem przechowywania kultur wirusów zapewniającym żywotność wirusom przez najdłuższy czas jest przetrzymywanie w zliofilizowanej tkance roślinnej.

Produktem rozdrabniania materiału roślinnego w toku izolowania wirusa z rośliny jest tzw. sok, czyli zawiesina różnych fragmentów komórek roślinnych i różnych organelli w roztworze rozpuszczalnych treści komórek. Cząstki wirusa występują tam w stanie wolnym albo są związane z innymi składnikami tej zawiesiny. Oczyszczanie wirusa, czyli dążenie do uzyskania preparatu wirusa w miarę możliwości wolnego od zanieczyszczeń, a jednocześnie zawierającego możliwie dużą ilość wirusa, musi uwzględniać jedną z dwóch możliwości: 1) próbujemy usunąć z zawiesiny wszystkie jej składniki niebędące cząstkami wirusa i wszystkie związki rozpuszczalne, starając się, by jak największa liczba cząstek wirusa pozostała w wodzie lub w roztworze o znanym składzie i właściwościach; 2) podejmujemy próbę wytrącenia z zawiesiny samych cząstek wirusa i sporządzamy z nich czystą zawiesinę w wodzie lub roztworze o znanym składzie i właściwościach. W praktyce procedury oczyszczania wirusów są wieloetapowe i na poszczególnych etapach są wykorzystywane różne podejścia i różne metody (Steere, 1959, 1964).

Jeśli mamy możliwość wyboru, do oczyszczania powinniśmy wybrać szczep (izolat) wirusa dobrze namnażający się i uzyskujący wysoką koncentrację w roślinie źródłowej. Pożądane jest, by wybrany izolat wywoływał wyraźne objawy na dogodnej roślinie wskaźnikowej (zob. podrozdz. 8.4.2). Powinien być także stabilny chemicznie i genetycznie. Roślina źródłowa musi być wolna od innych wirusów. Powinna być łatwa w uprawie i łatwa do inokulacji. Nie powinna zawierać inhibitorów wirusa ani ciemnych barwników i nie powinna mieć zbyt dużo tkanki mechanicznej. Powinna być dobrym środowiskiem do namnażania wirusa i zapewniać jego wysoki „plon” w możliwie krótkim czasie.

W niektórych przypadkach już w czasie ekstrakcji wirusa z tkanki roślinnej odpowiednimi buforami jest wskazane dodanie enzymów pektolitycznych i celulolitycznych w celu ułatwienia uwolnienia wirusa z tkanki. Jest to szczególnie wskazane w przypadku wirusów zlokalizowanych we floemie i stanowiących bardzo małą część masy tkanki (Takanami i Kubo, 1979). Z reguły ekstrakcję wirusa staramy się przeprowadzić mieszaniną buforów z rozpuszczalnikami organicznymi (butanol, pentanol, oktanol, chloroform). Emulsja taka łatwo się rozwarstwia. Po rozdzieleniu faz (np. przez wirowanie niskoobrotowe) różne fragmenty komórek roślinnych pozostają w fazie rozpuszczalnika organicznego, a wirus pozostaje w zawiesinie wodnej. Z zawiesiny tej można wytrącić wirus przez wysalanie np. siarczanem(VI) amonu albo przez doprowadzenie pH środowiska do punktu izoelektrycznego dla białka wirusa (np. przez zakwaszanie kwasem octowym). W tych warunkach wirus można strącić przez niskoobrotowe wirowanie (do 10 tys. g). Niepożądane substancje rozpuszczalne można usunąć przez dializę. Dalsze doczyszczanie wirusa można prowadzić przez wirowanie naprzemienne. Składa się ono z kilku cykli wirowania na przemian w zwykłej, niskoobrotowej wirówce (do 10 000 g) i w ultrawirówce (> 30 000 g). W czasie wirowania niskoobrotowego usuwamy resztki większych zanieczyszczeń, a wirowanie w ultrawirówce pozwala strącić (zatężyć) wirus.

Wirowanie w gradiencie gęstości (ang. density gradient centrifugation) sacharozy lub soli cezu pozwala uzyskać preparat wirusa o dużej czystości. W probówce wirówkowej sporządzamy roztwór sacharozy o malejących stężeniach (np. 40, 30, 20 i 10%) albo roztwór o tzw. gradiencie liniowym, w którym stężenie sacharozy zmienia się stopniowo ku górze probówki od 40 do 10% (zob. Noordam, 1973). Na tak przygotowany roztwór nakładamy preparat wstępnie oczyszczonego wirusa i rozpoczynamy wirowanie w rotorze uchylnym (około 25 000 g), przy którym probówka uzyskuje pozycję poziomą w czasie wirowania. Na cząsteczki sacharozy działa siła odśrodkowa przesuwająca je w kierunku dna probówki, podczas gdy przeciwdziałają jej siły dyfuzji „wypychające” cząsteczki sacharozy z niżej położonych warstw gradientu o większych stężeniach do wyższych, mniej gęstych stref gradientu. Przy dostatecznie długim wirowaniu początkowy gradient „schodkowy” automatycznie zmieni się w gradient liniowy. Niekiedy jednak wirowanie przerywamy po np. dwóch godzinach. Cząstki wirusa zawędrują w tym czasie tak daleko w głąb gradientu, jak na to pozwolą im przeciwdziałające sobie siły. Można je odzyskać ze strefy gradientu, w której się znalazły. Jest to zwykłe wirowanie w gradiencie gęstości (ang. rate-zonal density gradient centrifugation). Czasem jednak wirowanie kontynuuje się tak długo (np. 1 dobę), aż roztwór znajdzie się w równowadze, to znaczy wytworzy się gradient liniowy, w którym siła odśrodkowa nie pozwoli na dyfuzję cząsteczek sacharozy ku strefom o mniejszym stężeniu, ale nie będzie już w stanie przemieścić dalszych cząsteczek sacharozy do zbyt zagęszczonych stref gradientu. Cząstki wirusa osiągną pozycję w gradiencie, w której ich gęstość będzie równa gęstości roztworu. Jest to tzw. równoważne wirowanie w gradiencie gęstości (ang. equilibrium density gradient centrifugation). Po zaprzestaniu wirowania należy jak najszybciej rozdzielić poszczególne strefy gradientu, zanim wymieszają się one w wyniku swobodnej dyfuzji.

Sączenie molekularne na kolumnach Sephadeksu lub agarozy czy sefarozy doprowadza do rozdzielania cząstek w zależności od ich wielkości. Najszybciej przez kolumnę przeciekają największe cząstki, które są zbyt duże, by penetrować granulki żelu i przemieszczają się dość szybko między nimi pod wpływem siły ciężkości. Mniejsze cząstki penetrują granulki żelu w różnym stopniu, co wpływa na szybkość ich wędrówki. Po określonym czasie kolumnę przemywa się odpowiednio dobranym rozpuszczalnikiem i zbiera kolejne frakcje wypływające z kolumny.

Największy stopień czystości jest wymagany dla preparatów przeznaczonych do badań biochemicznych, fizykochemicznych i molekularnych. Preparat, którego chcemy użyć jako antygenu do wyprodukowania surowicy (zob. podrozdz. 2.3.2), może już nie być aż tak czysty. Musi być jednak wolny od resztek roślinnych i makromolekuł, a zwłaszcza białek innych niż białko wirusa. Preparaty przeznaczone do oglądania w mikroskopie elektronowym nie muszą być nawet tak czyste.

Czystość uzyskanego preparatu możemy wstępnie ocenić optycznie. Dopóki preparat ma jakąkolwiek barwę, nie jest czysty. Zawiesina wirusa powinna być bezbarwna. Jakiekolwiek widoczne zmętnienia również świadczą o niedostatecznej czystości. Preparat o zadowalającej czystości oglądany w świetle przechodzącym może lekko opalizować. Przejrzenie preparatu pod mikroskopem elektronowym pozwala względnie szybko i prosto ocenić czystość preparatu oraz rodzaj i stopień zanieczyszczeń. Dobrą metodą oceny czystości preparatu jest również pomiar spektrofotometryczny. Pomiar absorbancji (A) promieni UV o długości charakterystycznej dla białka (260 nm) i dla kwasów nukleinowych (280 nm) pozwala wyliczyć stosunek A260/280 i porównać go z charakterystyczną dla oczyszczanego wirusa wartością tego stosunku zależną od proporcji między ilością białka a ilością kwasu nukleinowego w cząstkach wirusa. Do oceny strat wirusa na różnych etapach procedury oczyszczania nadaje się szczególnie test biologiczny z użyciem rośliny reagującej plamkami lokalnymi (zob. podrozdz. 5.2). Liczba uzyskanych plamek jest w takim przypadku wykładnikiem liczby infekcyjnych cząstek wirusa w inokulum (Noordam, 1973; Dijkstra i de Jager, 1998; Kryczyński, 2005b). Również oznaczenie ilości wirusa w preparacie metodami serologicznymi (oznaczenie miana wirusa wobec określonego stężenia surowicy) może służyć do oceny strat wirusa na poszczególnych etapach procedury oczyszczania (Noordam, 1973; Kryczyński, 2005b).

Procedury oczyszczania różnych wirusów są w miarę szczegółowo opisane w wydawnictwie CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses (zob. podrozdz. 8.4.2) oraz, na przykład, w książce opracowanej przez wielu autorów (Brunt in., 2002), będącej przedrukiem bazy danych o wirusach, a także, oczywiście, w licznych specjalistycznych publikacjach naukowych.