Читать книгу Клиническая патофизиология - Коллектив авторов - Страница 12

Ниже коротко перечислены цели и возможности клинико-синдромологического и клинико-генеалогического методов (в том числе составление родословной и изучение близнецов), а также методов цитогенетической, биохимической и молекулярной диагностики.

Клинико-синдромологический метод. Клинико-синдромологический метод позволяет выявлять морфологические, биохимические и функциональные признаки наследственных форм патологии (например, дефицит плазменного фактора VIII при подозрении на гемофилию A; кариотип 45,Х0 при подозрении на синдром Шерешевского – Тёрнера; поражения скелета, сердечно-сосудистой системы и глаз при подозрении на синдром Марфана).

Клинико-генеалогический метод. Клинико-генеалогический метод выявляет патологические признаки и прослеживает особенности их передачи в поколениях при составлении родословной. Он включает:

– определение типа наследования (доминантного, рецессивного, ауто- или гоносомного);

– выявление носителей гена, определяющего развитие исследуемого признака (болезни);

– оценка пенетрантности (частоты проявления) гена – «носителя» патогенного признака;

– определение генетического риска (вероятности рождения больного ребенка).

Цель – установить закономерности наследования признака. Для этого составляют родословную, проводят цитогенетическую диагностику, биологическое моделирование.

Составление родословной начинают со сбора сведений о семье консультирующегося или пробанда. Консультирующимся называется лицо, обратившееся к врачу, или первое попавшее в поле зрения исследователя лицо. Пробанд – больной или носитель изучаемого признака, с которого начинается родословная. Во многих случаях консультирующийся и пробанд являются одним и тем же лицом. Дети одной родительской пары называются сибсами (братья и сестры). Семьей в узком смысле называют родительскую пару и их детей, но иногда и более широкий круг кровных родственников, хотя в последнем случае лучше применять термин род.

Близнецовый метод базируется на сравнительном анализе частоты определенного признака в разных группах близнецов, а также в сопоставлении с партнерами монозиготных пар между собой и общей популяцией. Идентичность близнецов по анализируемому признаку обозначают как конкордантность, а отличие – как дискордантность. Роль наследственности и факторов среды в возникновении патологии у близнецов оценивают по специальным формулам.

Цитогенетическая диагностика. Цитогенетическая диагностика основана на микроскопическом изучении хромосом с целью выявления структурных нарушений в хромосомном наборе (кариотипирование). В качестве материала используют тканевые культуры с большим числом делящихся клеток, чаще лимфоциты периферической крови. Хромосомы на стадии метафазы изучают при помощи специальных методов окрашивания и составляют идиограммы (систематизированные кариотипы с расположением хромосом от наибольшей к наименьшей), что позволяет выявлять геномные и хромосомные мутации.

Биохимическая диагностика. Биохимическая диагностика базируется на изучении биохимических показателей, отражающих сущность болезни (например, активность ферментов, наличие патологических метаболитов, концентрация компонентов ферментативной реакции).

Объекты исследования:

– метаболиты в биологических жидкостях и клетках (например, фенилаланин при фенилпировиноградной олигофрении; кетоновые тела при сахарном диабете);

– аномальные белки (например, гемоглобин [Hb] при гемоглобинопатиях);

– дефектные ферменты (например, холинэстераза, глутатион пероксидаза, каталаза).

Этапы исследования:

1) использование скрининговых программ диагностики (например, тонкослойной хроматографии, электрофореза, микробиологических методов);

2) применение подтверждающих методов (например, флюорометрических, спектрофотометрических, количественного определения метаболитов, тестирования активности фермента).

Молекулярная диагностика. При помощи методов ДНК-диагностики устанавливают последовательность расположения отдельных нуклеотидов, выделяют гены и их фрагменты, устанавливают их наличие в изучаемых клетках. К числу наиболее эффективных методов относятся гибридизация ДНК (блоттинг, in situ), клонирование ДНК, полимеразная цепная реакция.

Гибридизация ДНК. Для определения порядка расположения нуклеотидов в исследуемом генетическом материале изучаемую ДНК помещают в специальную среду, где происходит контакт ДНК с нитями другой нуклеиновой кислоты. В случае комплементарности каких-либо двух нитей происходит их «сшивка». При специальных исследованиях используют генетические «зонды» – фрагменты меченной радиоактивным изотопом однонитевой ДНК с известной последовательностью нуклеотидов.

Блот-гибридизация. Для выявления интересующих (в том числе мутантных) генов ДНК подвергают рестрикции. Полученные фрагменты ДНК подразделяют по молекулярной массе, денатурируют и переносят на носитель (нейлоновую или иную мембрану). Фиксированную на носителе в виде пятна ДНК гибридизируют с меченым радиоактивным изотопом ДНК- или РНК-зондом. В результате определяют положение аномального фрагмента ДНК.

Клонирование ДНК. С помощью специализированных ферментов (ДНК-рестриктаз) разрезают нить ДНК на отдельные группы генов или на единичные гены. Для изучения признаков (в том числе патологических), кодируемых данными генами, особенностей транскрипции и трансляции создают нужное количество копий данного гена.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР (специфическая амплификация небольшого участка ДНК) применяют для изучения регионов предполагаемых мутаций и других особенностей структуры ДНК. Для исследования можно использовать любой биологический материал, содержащий ДНК (например, кусочек ткани, содержащий каплю или пятно крови, смыв полости рта, луковицу корня волос). На первом этапе исследуемую ДНК расщепляют на две нити при нагревании до 95 – 98 °C. Затем одну из нитей гибридизируют и стимулируют синтез последовательности, комплементарной исследуемой ДНК (с помощью термофильной ДНК-полимеразы). Циклы реакции повторяют до накопления нужного количества ДНК. Эту методику разработал и предложил Кэри Муллис.

Биологическое моделирование. Биологическое моделирование проводят для анализа возможных генетических дефектов человека с использованием в качестве объекта исследования животных (здоровых или мутантных), а также для изучения возможных мутагенных и тератогенных эффектов лекарственных средств (ЛС) и других агентов, для разработки методов генной инженерии.

Принципы лечения. При лечении наследственных болезней (при соблюдении индивидуального характера помощи) применяют три основных подхода: этиотропный, патогенетический и симптоматический.

Этиотропная терапия. Этиотропный подход направлен на устранение причины заболевания. С этой целью разрабатываются, апробируются и частично могут быть применены методы коррекции генетических дефектов, называемые генной терапией. Генная терапия бурно развивается в последние годы, что является непосредственным следствием успешно выполняемой международной программы «Геном человека». В общем виде целью генной терапии является внесение в клеточный геном пораженных органов нормально экспрессируемого «здорового» гена, восполняющего функцию мутантного («больного») гена.

Непременным условием генной терапии конкретной наследственной патологии является наличие клонированного (и нормального!) гена, ответственного за развитие заболевания (моногенного, как правило). Конечная задача – внедрение нормального гена в геном клеток пораженного органа. Эта процедура выполняется при помощи трансфекции – введения в геном клетки вектора, содержащего нужный и здоровый ген человека. В качестве векторов обычно применяют модифицированные (дефектные по репликации) вирусы (ретро-, аденои др.). Процедуру трансфекции обычно выполняют ex vivo: при культивировании клеток больного человека, при успешном внедрении вектора с нужным геном в геном культивируемых клеток последние вводят тем или иным способом в нужный орган пациента.

В качестве клеток-мишеней для генной терапии применяют только соматические (но не половые) клетки – носители патогенных генов. В настоящее время апробированы и утверждены сотни генотерапевтических протоколов для лечения моногенных и многофакторных заболеваний (например, тяжелого комбинированного иммунодефицита, семейной гиперхолестеринемии, муковисцидоза, некоторых мышечных дистрофий, различных онкологических и инфекционных заболеваний).

Патогенетическая терапия. Цель патогенетической терапии – разрыв звеньев патогенеза. Для достижения этой цели применяют несколько методов.

Заместительная терапия – введение в организм дефицитного вещества (не синтезирующегося в связи с аномалией гена, который контролирует продукцию данного вещества: например, инсулина при сахарном диабете, соответствующих ферментов при гликогенозах и агликогенозах, антигемофильного глобулина человека при гемофилии).

Коррекция метаболизма путем :

– ограничения попадания в организм веществ, метаболически не усваивающихся (например, фенилаланина или лактозы);

– выведения из организма метаболитов, накапливающихся в нем в избытке (например, фенилпировиноградной кислоты или холестерина);

– регуляции активности ферментов (например, подавление активности креатинфосфокиназы при отдельных видах миодистрофий, активация липопротеинлипазы крови при гиперхолестеринемии).

Хирургическая коррекция дефектов (например, создание шунта между нижней полой и воротной венами у пациентов с «гепатотропными» гликогенозами).

Симптоматическая терапия. Симптоматическая терапия направлена на устранение симптомов, усугубляющих состояние пациента (например, применение веществ, снижающих вязкость секретов экзокринных желез при муковисцидозе; хирургическое удаление дополнительных пальцев и/или перемычек кожи между ними при полисиндактилии; выполнение пластических операций при дефектах лица, пороках сердца и крупных сосудов).

Профилактика. Цель профилактического направления медицинской генетики – предотвратить или снизить риск возникновения заболеваний: вновь появившихся вследствие мутации в половых клетках родителей; унаследованных от предыдущих поколений; возникающих в связи с наследственной предрасположенностью под влиянием факторов среды.

Эта цель может быть достигнута на четырех этапах индивидуального развития:

– прегаметическом (охрана здоровья человека в репродуктивном возрасте, охрана окружающей среды);

– презиготном (например, искусственная инсеминация, медико-генетическое консультирование);

– пренатальном (все виды дородовой диагностики);

– постнатальном (раннее выявление, «профилактическое лечение» – до развития симптомов заболевания; охранительный режим).

Методы профилактики. Медико-генетическое консультирование является основным видом профилактики врожденной и наследственной патологии. Задача консультирования – сформулировать прогноз для потомства, течения заболевания, качества жизни и здоровья.

Пренатальная диагностика. Пренатальная диагностика осуществляется вIиIIтриместрах беременности (в периоды, когда возможно прерывание беременности при обнаружении патологии плода).

Методы диагностики. Ультразвуковое исследование (УЗИ) позволяет установить наличие беременности, количество плодов, выявлять грубые аномалии плода. Биохимическое исследование сыворотки крови матери: определение концентрации альфа-фетопротеина, хорионического гонадотропина, несвязанного эстриола и других веществ – с целью диагностики врожденных пороков развития и скрининга хромосомной патологии. Фетоскопия обеспечивает прямое наблюдение плода с помощью специальной оптической системы, позволяет диагностировать заболевания кожи, нарушения развития половых органов, дефекты лица, конечностей и пальцев, производить биопсию тканей плода.

Цитогенетические, биохимические и молекулярно-генетические методы применяют на материале, полученном при следующих вмешательствах:

– амниоцентез позволяет получить амниотическую жидкость путем пункции амниона, проводят на 15 – 17-й неделях беременности;

– кордоцентез обеспечивает возможность взятия крови плода путем пункции пуповины, проводят на 15 – 17-й неделе беременности;

– хорионбиопсия – взятие для исследования ворсин хориона, клетки которого генетически идентичны клеткам развивающегося организма, проводят на 6–11-й неделе беременности.

Преклиническая диагностика – скрининг с целью ранней диагностики наследственных болезней обмена веществ у новорожденных. Применяют относительно простые, но надежные методы.

Скринингу подлежат наследственные заболевания обмена:

– приводящие к гибели или инвалидизации (без раннего выявления и своевременного лечения);

– встречающиеся с частотой не реже чем1:20000 – 1: 50 000 новорожденных;

– имеющие адекватные и экономичные методы предварительного выявления;

– подвергающиеся эффективному лечению, реабилитации и адаптации.

Диспансеризация семей с наследственной патологией проводится с целью предупреждения рождения больного ребенка или зачатия аномального плода (первичная профилактика).

Контроль мутагенной опасности факторов окружающей среды реализуется путем предотвращения образования, снижения содержания, длительности и/или силы действия на организм химических, физических и биологических мутагенных агентов. Достигается комплексом организационных и гигиенических мер на производстве, в учреждениях и быту (например, возведением очистных сооружений, применением спецодежды, очисткой воздуха, воды и продуктов питания, использованием средств противорадиационной защиты).

Важным фактором приспособления клетки к повреждению является гетерогенность ее ультраструктур. В обычных условиях в клетке функционируют не все, а только часть органелл, например митохондрий; остальные митохондрии находятся в состоянии относительного покоя. В дальнейшем, по мере «изнашивания» молекулярных компонентов, происходит смена митохондрий: ранее покоящиеся органеллы начинают усиленно функционировать, а усиленно функционирующие переходят в состояние относительного покоя.

Таким образом, в любой клетке существует определенный функционально-структурный резерв. Рассмотренная закономерность жизнедеятельности клетки определяет, по крайней мере, три особенности:

– «покоящаяся» органелла по сравнению с гиперфункционирующей имеет более высокую резистентность и может сохранять свои свойства при повреждении;

– в условиях приспособления к повреждающим факторам клетка может компенсировать энергообеспечение за счет включения этого резерва;

– после повреждения ультраструктур и снижения функции, в частности митохондрий, в клетке немедленно включается важнейший приспособительный процесс – внутриклеточная регенерация (восполнение числа этих органелл), реализующаяся через генетический аппарат клетки.

В целях предупреждения наследственных заболеваний рекомендуют проведение следующих мероприятий:

– ограничение браков между близкими и даже дальними родственниками;

– ликвидация популяционных, обычно расовых или религиозных, изолятов;

– получение детей от здоровых, молодых и любящих родителей;

– популяризация здорового образа жизни;

– осуществление оздоровления внешней среды;

– жизнь в экологически чистой местности;

– использование качественной воды и пищи.