Читать книгу Padaczka. Etiologia - Группа авторов - Страница 6

Diagnostyka genetyczna jest rekomendowana przez Międzynarodową Ligę Przeciwpadaczkową (ILAE, International League Against Epilepsy) jako diagnostyka szczegółowa (po badaniach EEG, MR i badaniach biochemicznych) po nieskutecznym leczeniu padaczki lekami pierwszego rzutu i u niemowląt z napadami padaczkowymi [68, 69]. Zasadniczo nie zaleca się diagnostyki genetycznej w przypadku pacjentów dobrze odpowiadających na leki przeciwpadaczkowe [69].

Porównawcza hybrydyzacja genomowa z wykorzystaniem mikromacierzy – aCGH (array-Comparative Genomic Hybridization) umożliwia wykrywanie aberracji liczby chromosomów (poza zaburzeniami ploidii genomu), mikrodelecji i mikroduplikacji z rozdzielczością wielokrotnie wyższą od uzyskiwanej w badaniu kariotypu. Występowanie w genomie wielu wariantów liczby kopii fragmentów chromosomowych (CNVs, copy numer variants), nie zawsze mających znaczenie kliniczne, wymaga dużego doświadczenia i ostrożności w interpretacji wyników. CNVs o znaczeniu klinicznym obserwuje się u 10% pacjentów z dziecięcą padaczką i u 5% pacjentów z EP. aCGH jest szczególnie zalecana w przypadkach osób chorujących na padaczkę, u których obserwuje się dodatkowe objawy, takie jak dysmorfia, wady wrodzone i inne niż padaczka objawy neurologiczne bądź psychiatryczne. Skuteczność aCGH jest większa w przypadku pacjentów z padaczką i niepełnosprawnością intelektualną [4, 70–77].

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH, fluorescent in situ hybridization) była powszechnie wykorzystywana przy podejrzeniu zespołów mikrodelecji lub mikroduplikacji chromosomowych [78]. Jest obecnie skutecznie zastępowana przez metodę MLPA i aCGH, wykorzystywana sporadycznie w diagnostyce epileptologicznej, przede wszystkim u osób z podejrzeniem mozaikowej formy trisomii.

MLPA – multipleksowa amplifikacja sond zależna od ligacji (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) służy do identyfikacji mikrodelecji i mikroduplikacji chromosomowych, w tym zakresie zastąpiła metodę FISH. Ma tę przewagę nad aCGH, że wykrywa także wewnątrzgenowe delecje lub duplikacje (delecje i duplikacje eksonów genów lub całych genów). Tego typu rearanżacji eksonów nie wykrywa się, stosując sekwencjonowanie tradycyjne (metodą Sangera) lub sekwencjonowanie następnej generacji. W epileptologii wykorzystywana (poza poszukiwaniem mikrodelecji/mikroduplikacji chromosomowych) m.in. do pogłębionych badań genów SCN1A, CDKL5, MECP2, SLC2A1 [78].

Kariotyp – metoda wykorzystywana do diagnostyki dużych aberracji chromosomowych liczby i struktury [79]. Zastępowana przez aCGH. Ma tę przewagę nad aCGH, że pozwala na identyfikację triploidii i zrównoważonych aberracji chromosomowych, co rzadko ma znaczenie w epileptologii.

Sekwencjonowanie następnej generacji

Sekwencjonowanie metodą Sangera (sekwencjonowanie tradycyjne, metodą „gen po genie”) jest obecnie wypierane w diagnostyce genetycznej padaczki przez sekwencjonowanie następnej generacji (NGS, next generation sequencing). Sekwencjonowanie następnej generacji umożliwia równoczesne, szybkie sekwencjonowanie całego genomu (kompletnej sekwencji genów i obszarów pozagenowych), eksomu (eksonów wszystkich znanych genów człowieka; WES, whole exome sequencing), wszystkich znanych genów związanych z chorobami człowieka (tzw. eksom kliniczny) lub eksonów określonych genów (panele NGS). NGS jest wykorzystywany w przypadku pacjentów chorujących na padaczkę, u których podejrzewa się przyczynę jednogenową, a potencjalnych genów mogących być przyczyną obserwowanych objawów jest wiele. Potencjalna patogenność wykrywanych wariantów wymaga ostrożnej interpretacji, kluczowe znaczenie ma jakość analizy bioinformatycznej wyników. Mutacje w rejonach regulatorowych, niekodujących białek nie będą zidentyfikowane badaniem opartym na NGS, podobnie jak mutacje w genomie mitochondrialnym, mutacje dynamiczne w genach i wspomniane wyżej warianty liczby kopii (CNVs) oraz delecje i duplikacje całych eksonów genów [1, 80, 81]. Nie wszystkie fragmenty analizowanych genów są badane z równą czułością. Należy przyjąć, że prawidłowy wynik NGS nie wyklucza w 100% istnienia mutacji punktowej w obszarach kodujących badanych genów.

Wybór metody diagnostycznej w przypadku pacjentów chorujących na padaczkę, u których podejrzewa się podłoże genetyczne, zależy od rodzaju padaczki i schorzeń towarzyszących. W przypadku pacjentów z fenotypem odpowiadającym określonemu zespołowi padaczkowemu metodą podstawową jest panel genowy oparty na NGS lub WES. Panele genowe identyfikują przyczynę padaczki u 22% pacjentów z padaczką z początkiem w okresie niemowlęcym [67]. Skuteczność WES to 14,3–27% w przypadku pacjentów z padaczką lekooporną, a 45% w przypadku pacjentów z opóźnieniem rozwoju/niepełnosprawnością intelektualną. W razie niezidentyfikowania mutacji przyczynowej powyższymi metodami zaleca się badanie metodą aCGH, badania MLPA pojedynczych genów, wytypowanych na podstawie fenotypu oraz sekwencjonowanie metodą Sangera pojedynczych genów (np. SCN1A). Jeżeli objawy występujące u pacjenta nie mogą być zakwalifikowane do żadnego znanego zespołu padaczkowego, diagnostykę genetyczną należy rozpocząć od badania aCGH, w następnej kolejności wykonać panel genowy NGS lub badanie WES. Metodą aCGH identyfikujemy przyczynę padaczki u 23,5% pacjentów z niepełnosprawnością intelektualną/opóźnieniem rozwoju [80, 81]. WGS nie jest w większości krajów podstawową metodą diagnostyczną, ma zastosowanie w badaniach naukowych w epileptologii [78]. Sekwencjonowanie metodą Sangera służy do identyfikacji zmian w pojedynczych genach, wytypowanych na podstawie określonego fenotypu u pacjenta (np. zespołu Pitta-Hopkinsa) oraz, co ważne, do potwierdzania obecności stwierdzanych w badaniach NGS wariantów nukleotydowych, co pozostaje standardem.