Читать книгу Choroby wirusowe w praktyce klinicznej - Группа авторов - Страница 79

Swoista diagnostyka wirusologiczna zakażeń OUN opiera się najczęściej na kombinacji metod bezpośrednich (wykrycie wirusowych kwasów nukleinowych lub antygenów, izolacja wirusa w liniach komórkowych) oraz pośrednich (wykrywanie przeciwciał w surowicy krwi i/lub PMR). Najpopularniejszą obecnie techniką służącą do diagnostyki bezpośredniej wirusowych zakażeń OUN jest metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (polymerase chain reaction, PCR) z detekcją w czasie rzeczywistym (qPCR) lub jego wariant poprzedzony odwrotną transkrypcją, służący do wykrywania wirusów RNA. Jest to technika o bardzo wysokiej czułości i swoistości, a dane szacunkowe mówią, że dzięki jej szerokiemu rozpowszechnieniu wykrywalność patogenów odpowiedzialnych za infekcje OUN wzrosła prawie 100-krotnie. Jednak stosowanie qPCR wiąże się także z pewnymi problemami. Testy te powinny przejść proces walidacji dla szeregu materiałów badanych w diagnostyce wirusowych zakażeń OUN, takich jak PMR, krew pełna, osocze, surowica, wymazy ze skóry i błon śluzowych oraz mocz. Powinny też cechować się odpowiednim progiem czułości – granica wykrywalności nie powinna być niższa niż 200–500 kopii wirusa/ml materiału, co jest szczególnie ważne w przypadku badania PMR i krwi obwodowej. Z racji tego, że podobne objawy mogą towarzyszyć zakażeniu wieloma różnymi wirusami, ważne jest zastosowanie qPCR do wykrywania wielu patogenów w pojedynczej reakcji. Przy użyciu zwykłej odmiany qPCR teoretycznie można wykrywać 4–5 różnych patogenów, natomiast w praktyce rzadko się zdarza, aby pojedynczy test wykrywał > 2 różne wirusy. Rozwiązaniem tego problemu może być wprowadzenie na szerszą skalę alternatywnych odmian qPCR, z możliwością jednoczesnego wykrywania kilkunastu lub więcej wirusów w pojedynczej reakcji.

5.6.1. DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA ZAKAŻEŃ WYWOŁANYCH PRZEZ HERPESWIRUSY

Zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu w przebiegu uogólnionego zakażenia HSV-1 lub HSV-2 noworodków wymaga pobrania do badań wirusologicznych PMR, krwi obwodowej, moczu oraz wymazów ze zmian skórnych, spojówek, nosogardzieli i odbytu. Materiał może być wykorzystany do izolacji wirusa w hodowlach komórkowych lub jego wykrycia za pomocą czułych i swoistych metod bezpośrednich, jak PCR lub qPCR, czy też metod immunoenzymatycznych. Metoda PCR z detekcją w czasie rzeczywistym wykazuje znacząco wyższą czułość i swoistość w porównaniu z innymi metodami wykrywania i identyfikacji HSV w PMR i we krwi.

Objawy HSE są absolutnym wskazaniem do wykonania badań wirusologicznych. Obecnie zaleca się wykrywanie wirusowego DNA w próbkach PMR przy użyciu techniki qPCR. Należy pamiętać, że w 1. tyg. po rozpoczęciu leczenia DNA HSV wykrywa się u większości pacjentów, w 2. tyg. – u 50%, a po 2 tyg. – u < 20% chorych. Badanie to jest jednocześnie przydatnym narzędziem monitorowania terapii. Izolacja HSV z PMR w hodowlach komórkowych nie jest zalecana w diagnostyce HSE u dzieci > 6. mies. życia i starszych (jak również u osób dorosłych) ze względu na nikłą szansę wyhodowania wirusa. Ze względu na to, że HSE jest z reguły wynikiem reaktywacji latentnej formy wirusa, wirusowy DNA we krwi wykrywa się rzadko.

Wykrywanie mutantów HSV opornych na acyklowir i jego pochodne opierać się może na badaniu wrażliwości in vitro szczepów wyizolowanych i namnożonych w liniach komórkowych przy użyciu technik redukcji miana lub też przy użyciu metod biologii molekularnej identyfikujących prawidłowy gen kinazy tymidynowej HSV-1/HSV-2.

Powikłania neurologiczne ospy wietrznej przebiegającej typowo diagnozowane są najczęściej na podstawie obrazu klinicznego, ogólnych badań laboratoryjnych oraz diagnostyki obrazowej. W przypadkach nietypowych diagnostyka opiera się na wykryciu DNA VZV w PMR i we krwi pełnej, a metodą z wyboru jest qPCR. Wirusowy DNA wykrywa się często w ciągu 1. tyg. od pojawienia się objawów, następnie szansa wykrycia DNA VZV w PMR stopniowo maleje. W rzadkich przypadkach, gdy wirusowy DNA w PMR jest niewykrywalny, przydatne mogą być badania serologiczne. W diagnostyce bezpośrednich powikłań neurologicznych ospy wietrznej wykrywa się swoiste przeciwciała w klasie IgM w surowicy krwi. W przypadku późnych powikłań neurologicznych ospy wietrznej, na przykład zapalenia naczyń w obrębie OUN, a także w diagnostyce powikłań neurologicznych półpaśca, przydatne okazuje się określenie indeksu przeciwciał, czyli porównanie poziomu przeciwciał ogólnych i anty-VZV IgG w surowicy krwi oraz w PMR. Zaleca się testy ELISA wykorzystujące rekombinowany antygen gE VZV oraz korektę wyniku zgodnie z diagramem Reibera. Izolacja VZV z płynu mózgowo-rdzeniowego w hodowlach komórkowych jest mało przydatna.

Diagnostyka zakażeń OUN powodowanych przez wirus cytomegalii u osób dorosłych, zarówno w przebiegu AIDS, jak i rzadkich powikłań neurologicznych obserwowanych u biorców przeszczepów, opiera się na wykryciu DNA CMV w PMR: wykazano jednoznacznie silną korelację między nasileniem objawów a wykrywaną liczbą kopii DNA CMV. Z racji tego, że liczba kopii wirusowego DNA w PMR u osób HIV-ujemnych rzadko przekracza 10³/ml, należy korzystać z testów o odpowiedniej czułości. Duża liczba kopii DNA CMV (tj. > 10⁵ kopii/ml) obserwowana jest w przebiegu pełnoobjawowego AIDS u osób z zapaleniem mózgu lub komór mózgu, a także przy wielokorzeniowym zapaleniu nerwów. Diagnostyka zakażeń wrodzonych CMV opiera się w głównej mierze na wykrywaniu DNA wirusa i polega na badaniu płynu owodniowego pobranego od kobiety ciężarnej z potwierdzoną infekcją CMV, natomiast po urodzeniu badanie powinno zostać przeprowadzone jak najszybciej u noworodka (nie później niż 2 tyg. po urodzeniu). Materiał genetyczny wirusa wykrywa się w moczu lub ślinie oraz we krwi dziecka. Wykrywanie swoistych przeciwciał w klasie IgM w surowicy noworodka jest uznawane obecnie za metodę o niewystarczającej czułości.

Z racji braku praktycznej alternatywy wykrywanie DNA wirusa Epsteina-Barr w PMR jest najczęściej jedynym dostępnym badaniem wirusologicznym, lecz diagnostyka neuroinfekcji powodowanych przez EBV wiąże się z 2 głównymi problemami. Po pierwsze, brak jest na rynku testów zwalidowanych do wykrywania DNA EBV w próbkach PMR; po drugie, wykrycie DNA EBV we krwi pacjentów z zaburzeniami neurologicznymi nie musi oznaczać, że EBV jest odpowiedzialny za zakażenie OUN. Dodatkowym problemem jest diagnostyka zapalenia mózgu: u 25% pacjentów z objawami tej choroby, u których wykryto DNA EBV w PMR, objawy wywołane były przez inny czynnik zakaźny (HSV-1, WNV, CMV, JCV, Mycoplasma spp., Ehrlichia spp., Cryptococcus neoformans). Najbardziej przydatna wydaje się diagnostyka kompleksowa, polegająca na badaniu PMR pod kątem liczby limfocytów, ocenie ilościowej DNA EBV przy użyciu qPCR oraz porównaniu poziomu przeciwciał anty-VCA IgG w surowicy krwi i w PMR.

Mimo dostępności testów służących zarówno do wykrywania wirusowego materiału genetycznego, jak i swoistych przeciwciał, diagnostyka zakażeń OUN powodowanych przez ludzkie herpeswirusy typu 6 jest w praktyce trudna, głównie ze względu na brak zaleceń dotyczących postępowania diagnostycznego oraz jasnych kryteriów interpretacyjnych. Jedynym badaniem jednoznacznie potwierdzającym etiologię HHV-6 w zakażeniach OUN jest wykrycie DNA lub antygenów wirusa w bioptatach tkanki mózgowej, lecz badanie takie ze zrozumiałych względów jest wykonywane bardzo rzadko. Obecny konsensus sprowadza się do stwierdzenia, że diagnostyka powinna uwzględniać syntezę informacji klinicznych oraz wyników dostępnych badań diagnostycznych, w tym wirusologicznych, przy jednoczesnym wykluczeniu innych przyczyn objawów neurologicznych. Głównym badaniem wirusologicznym pozostaje zatem wykrycie DNA HHV-6 w próbkach PMR, przy czym problemem jest ryzyko uzyskania wyników dodatnich spowodowanych wykryciem ciHHV-6 w tych próbkach, nie zaś aktywnie replikującego się wirusa. Analogicznie do przypadku EBV, obecność DNA HHV-6 we krwi obwodowej nie musi pozostawać w związku z zakażeniem OUN.

5.6.2. DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA ZAKAŻEŃ WYWOŁANYCH PRZEZ PIKORNAWIRUSY

Potwierdzeniem zakażenia OUN wywołanego przez enterowirusy jest izolacja wirusa w hodowli komórkowej lub wykrycie wirusowego RNA w PMR. Dodatkowe badania obejmują izolację wirusa z kału (wirus może być obecny w kale tygodnie lub nawet miesiące po ustąpieniu objawów ze strony OUN) oraz badania serologiczne, polegające na wykryciu swoistych przeciwciał w surowicach parzystych. Problemem pozostaje dokładna identyfikacja typu enterowirusa odpowiedzialnego za zakażenie. Większość dostępnych metod biologii molekularnej wykorzystuje amplifikację konserwatywnego regionu 5’UTR, zawierającego sekwencje identyczne dla wszystkich EV. Określenie serotypu wirusa jest teoretycznie możliwe poprzez izolację wirusa w hodowli i dalszą identyfikację z użyciem odczynu fluorescencji bezpośredniej lub neutralizacji wirusa, jednak w warunkach polskich nie ma dostępu do takich technik. Dodatkowym ograniczeniem jest niska czułość technik hodowlanych w porównaniu z metodami opierającymi się na powieleniu wirusowego RNA.

Laboratoryjne potwierdzenie podejrzenia poliomyelitis opiera się zawsze na izolacji wirusa w hodowli komórkowej oraz jego typowaniu. Najbardziej odpowiednim materiałem do izolacji poliowirusów jest kał, mniejszą przydatność wykazują wymazy z gardła, natomiast krew i PMR są do tego celu praktycznie nieprzydatne. Typ wirusa można określić przy wykorzystaniu swoistych przeciwciał przeciwko PV1, PV2 lub PV3, jednak w ostatnich latach typowanie oraz analiza genetyczna wskazująca, czy wyizolowany wirus reprezentuje szczep dziki czy szczepionkowy, opiera się na sekwencjonowaniu wybranych regionów genomu wirusowego.

5.6.3. DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA PML

„Złoty standard” diagnostyki laboratoryjnej postępującej wieloogniskowej leukoencefalopatii (PML) powodowanej przez wirus JC wymaga uzyskania próbki tkanki mózgowej. Diagnoza opiera się na stwierdzeniu charakterystycznej triady histopatologicznej (wieloogniskowa demielinizacja, oligodendrocyty z powiększonym i przebarwionym jądrem oraz atypowe astrocyty) oraz wykryciu antygenów lub DNA wirusa in situ przy użyciu technik immunohistochemicznych lub hybrydyzacji kwasów nukleinowych. Jednak w praktyce rozpoznanie stawiane jest najczęściej na podstawie 3 uzupełniających się informacji:

• obrazu klinicznego;

• badań obrazowych, najczęściej rezonansu magnetycznego;

• wykrycia DNA JCV w płynie mózgowo-rdzeniowym.

5.6.4. DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA POWIKŁAŃ NEUROLOGICZNYCH ODRY, ŚWINKI I RÓŻYCZKI

Diagnostyka bezpośrednich powikłań neurologicznych powodowanych przez wirusy odry, świnki i różyczki opiera się na podobnych zasadach i obejmuje wykrycie wirusowego RNA w PMR oraz swoistych przeciwciał klasy IgM w surowicy krwi i/lub w PMR. Diagnostyka wirusologiczna podostrego stwardniającego zapalenia mózgu (SSPE) wykorzystuje ocenę poziomu przeciwciał przeciwko wirusowi odry (MeV) w surowicy krwi oraz w PMR, a także wykrywanie RNA wirusa w PMR, przy czym szansa uzyskania wyniku dodatniego takiego badania jest niewielka.

5.6.5. DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA WŚCIEKLIZNY

Przyżyciowa diagnostyka laboratoryjna zakażeń wirusem wścieklizny obejmuje:

• izolację wirusa ze śliny w linii komórek neuroblastomy;

• wykrycie RNA wirusa w ślinie;

• wykrycie antygenu wirusa metodą immunofluorescencji bezpośredniej (DFA) w ślinie lub bioptatach skóry zawierających mieszki włosowe (w przypadku zakażenia wykrywa się antygeny wirusa w zakończeniach nerwów czuciowych);

• wykazanie testem neutralizacji obecności swoistych przeciwciał przeciw wirusowi wścieklizny w surowicy krwi lub w PMR.

5.6.6. DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA ZAKAŻEŃ UKŁADU NERWOWEGO WYWOŁANYCH PRZEZ ARBOWIRUSY

Diagnostyka zakażeń OUN powodowanych przez arbowirusy polega na wykryciu swoistych przeciwciał w klasie IgM lub stwierdzeniu serokonwersji w badaniu surowic parzystych oraz wykryciu wirusowego RNA w PMR. Metodą wykrywania wirusowego RNA jest najczęściej technika qPCR poprzedzona odwrotną transkrypcją, przy czym ważny jest dobór testu ze względu na jego zdolność do swoistego wykrycia konkretnego wirusa lub potwierdzenie wyniku dodatniego z użyciem zestawu oligonukleotydów wykrywających inną sekwencję wirusa. Ma to duże znaczenie zwłaszcza w przypadku flawiwirusów i jest związane z ich dużą zmiennością genetyczną. Z drugiej strony, w testach serologicznych obserwuje się reakcje krzyżowe między antygenami różnych gatunków flawiwirusów przenoszonych przez stawonogi, co może być przyczyną wyników fałszywie dodatnich.