Читать книгу Choroby zakaźne i pasożytnicze - Группа авторов - Страница 52

7.2.1. Posiewy

W celu właściwej identyfikacji mikroorganizmów za pomocą posiewu konieczne jest zastosowanie odpowiedniego sztucznego medium stałego lub płynnego. Podłoża płynne są używane do materiałów, w których podejrzewa się niewielkie stężenie patogenu (krew, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyny dializacyjne, płyn otrzewnowy). Podłoża płynne mogą być przesiane na podłoża stałe po wykryciu wzrostu bakterii. Aktualnie do niektórych posiewów, w tym do posiewów krwi, najczęściej stosuje się systemy automatyczne wykrywające dwutlenek węgla z oceną ciśnienia gazu, zmętnienia próbki lub hemolizy, sygnalizujące obecność drobnoustrojów, co pozwala na szybką identyfikację i przesianie próbek dodatnich. Systemy automatyczne są również stosowane dla hodowli Mycobacterium spp. przy zastosowaniu odpowiednich podłoży płynnych. Użycie podłoży płynnych może pozwolić na wykrycie wzrostu Mycobacterium tuberculosis w ciągu około 2 tygodni (> 4 tygodni dla podłoża Lowensteina), choć próbki powinny być hodowane co najmniej 8 tygodni.

W praktyce najczęściej stosuje się podłoża uniwersalne, pozwalające na wykrywanie szerokiego wachlarza klinicznie istotnych patogenów, również takich, które produkują małe ilości dwutlenku węgla (np. Acinetobacter spp.).

Posiewy krwi pobiera się w momencie narastania temperatury ciała, optymalnie przed szczytem gorączki, w parach umożliwiających zarówno hodowle tlenowe, jak i beztlenowe. Pobranie 3 zestawów posiewów krwi pozwala na czułość detekcji bakteriemii na poziomie 93,9% a 4 około 99%. U osób w stanie ogólnym ciężkim posiewy krwi należy pobrać bezpośrednio po sobie z 2 osobnych wkłuć, z następowym podaniem antybiotyku i powtórzeniami posiewu po 24 i ewentualnie 48 godzinach. Materiały z posiewem powinny być dostarczone do laboratorium mikrobiologicznego najszybciej jak to możliwe, a do czasu dostarczenia powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej. Należy unikać przechłodzenia próbek w czasie transportu.

Systemy automatyczne pozwalają na szybką identyfikację bakterii na podstawie ich fenotypu – izolaty są hodowane na różnych substratach. Wykorzystuje się też komercyjne testy enzymatyczne, których wyniki porównuje się ze standardami odpowiadającymi danej bakterii. Do identyfikacji produktów bakteryjnej przemiany materii, stanowiących swoisty „odcisk palca” danego patogenu można również stosować chromatografię gazową lub cieczową. Chromatografia pozwala także na identyfikację długołańcuchowych kwasów tłuszczowych ścian i błon komórkowych oraz grzybów, co przekłada się na dokładną identyfikację gatunkową.

7.2.2. Oznaczenie lekowrażliwości na antybiotyki

Testy lekowrażliwości (antybiogram) są modelami in vitro i nie uwzględniają wieloczynnikowej dynamiki zakażenia in vivo (farmakodynamika i farmakokinetyka, zmiany stężeń leków w poszczególnych tkankach, charakterystyka immunologiczna gospodarza). Badania lekowrażliwości mogą być ilościowe lub jakościowe. Metody jakościowe pozwalają na określenie trzech kategorii lekowrażliwości:

• wrażliwe (S – susceptible);

• średniowrażliwe (I – intermediate);

• oporne (R – resistant).

Do określania lekowrażliwości najczęściej stosowana jest metoda dyfuzyjno-krążkowa, w której na podłoże hodowlane nakłada się krążki nasycone antybiotykiem z oceną średnicy strefy zahamowania wzrostu mikroorganizmów. Antybiotyki są dobierane do gatunku bakterii. Średnica strefy zahamowania wzrostu jest przekładana na kategorię lekowrażliwości zgodnie z wytycznymi dla danego patogenu. Metody ilościowe lub półilościowe określają minimalne stężenia hamujące wzrost danego patogenu (MIC), które pozwala na podanie wartości numerycznej i jej przełożenie na kategorię lekowrażliwości. W celu oszacowania MIC można stosować metody rozcieńczeniowe (inkubacja w seryjnych rozcieńczeniach antybiotyku na podłożach stałych lub płynnych z zakresami zależnymi od danego gatunku mikroorganizmu lub rodzaju antybiotyku) z identyfikacją granicznego rozcieńczenia (brakepoint). Typowo MIC określa się dla bakterii i grzybów. Parametr ten pozwala na ocenę korelacji pomiędzy lekowrażliwością danego organizmu a możliwym do osiągnięcia tkankowym stężeniem leku, co stanowi podstawę skutecznej terapii.

Lekowrażliwość można również określić metodami półilościowymi z użyciem komercyjnie dostępnych gotowych testów diagnostycznych pozwalających na odczyty manualne lub automatyczne. Metodą łączącą zasadę dyfuzji i gradientu rozcieńczeń jest tzw. Etest – na podłoże agarowe nakłada się paski nasączone antybiotykiem o różnych stężeniach, co pozwala na bezpośredni odczyt MIC. Krajowy Ośrodek Referencyjny dla Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) na podstawie rekomendacji EUCAST ustala graniczne wartości punktów odcięcia MIC i określenia kategorii lekowrażliwości dla poszczególnych grup leków. W celu oceny profilu oporności na antybiotyki stosuje się metody kilku krążków, podłoża chromogenne czy metody molekularne, pośrednio pozwalające na identyfikację sekwencji genetycznej odpowiadającej genom lekooporności, co szczegółowo opisano w dalszej części rozdziału.

7.2.3. Hodowle wirusowe

Hodowle wirusowe pozwalają na identyfikację patogenu poprzez stymulację jego replikacji, choć są często technicznie skomplikowane, drogie i czasochłonne. Próbki inokuluje się na podłożach linii komórkowych z identyfikacją efektu cytopatycznego (zespołu zmian degeneracyjnych) w odpowiedzi na zakażenie wirusowe. Czas do wystąpienia efektu cytopatycznego i jego charakter pozwalają na wstępną identyfikację patogenu, do identyfikacji ostatecznej używana jest immunofluorescencja. Hodowle wirusów, m.in. herpeswirusów, zostały wyparte przez molekularne metody detekcji. Obecnie wykorzystywane są głównie w przypadku podejrzenia zakażenia HIV u dzieci otrzymujących profilaktykę lekami antyretrowirusowymi. Badanie pozwala na potwierdzenie lub wykluczenia aktywnego zakażenia w warunkach zahamowanej lekami replikacji tego wirusa w surowicy krwi. Hodowle wirusowe są również standardową techniką badawczą w analizach naukowych.