Читать книгу Choroby zakaźne i pasożytnicze - Группа авторов - Страница 54

Wykrywanie patogenów metodami molekularnymi stało się podstawą diagnostyki w chorobach zakaźnych, pozwalając na szybką i specyficzną identyfikację obecności materiału genetycznego danego patogenu i umożliwiając szybką optymalizację terapii. Metodami molekularnymi można wykryć zarówno RNA, jak i DNA, często z wykorzystaniem testów amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT). Diagnostyka molekularna w większości przypadków ma wąskie spektrum – służy do wykrywania pojedynczych patogenów. W związku z tym do klinicysty należy decyzja o wyborze kierunku badania. Aktualnie rozwijane są testy pozwalające wykryć i zróżnicować materiał genetyczny kilku lub kilkunastu patogenów jednocześnie (testy multipleksowe). Doskonalone są także techniki wykrywania mikroorganizmów oparte na mikrochipach, ligacji czy pirosekwencjonowaniu, choć ich zastosowanie dla konkretnych patogenów nie zostało jeszcze zoptymalizowane klinicznie.

7.4.1. Hybrydyzacja

Techniki hybrydyzacji pozwalają na wykrycie obecności materiału genetycznego mikroorganizmu w próbkach tkankowych, w tym w utrwalonych preparatach histologicznych czy cytologicznych. Hybrydyzacja in situ (z miejscowym wykryciem materiału genetycznego) pozwala przykładowo na wykrycie CMV, HPV czy EBV. Techniki hybrydyzacji stosowane są również do wykrywania paciorkowców grupy A i zakażeń przenoszonych drogą płciową (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis). Podstawą metodologii jest przyłączanie (hybrydyzacja) specyficznej sondy molekularnej do RNA/DNA poszukiwanego mikroorganizmu z następową detekcją sygnału metodą radiometryczną, kolorymetryczną, fluorymetryczną lub chemiluminescencyjną. Techniki hybrydyzacji pozwalają na bezpośrednie wykrycie danego patogenu, bez konieczności amplifikacji jego kwasów nukleinowych.

7.4.2. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Reakcja łańcuchowej polimerazy (PCR) pozwala na amplifikację sygnału wykrywającego obecność kwasów nukleinowych (DNA i RNA) z zastosowaniem specyficznych starterów w celu uzyskania widocznego produktu reakcji lub fluorescencji wyraźnie różniącej się od tła. Technicznie do wykonania reakcji konieczne jest wielokrotne szybkie podgrzewanie i ochładzanie próbki badanego materiału genetycznego z zastosowaniem polimerazy, co pozwala na separację nici kwasów nukleinowych, przyłączanie i wydłużanie starterów oraz wykrywanie sygnału (jeśli stosowano sondę molekularną). Testy PCR są wysoko specyficzne, a ich czułość zależy od obecności materiału genetycznego mikroorganizmu w badanej próbce. W związku z tym, że opierają się na specyficznych starterach/sondach, ich czułość zmniejsza się w przypadku rekombinacji lub mutacji mikroorganizmów (może dojść do obniżenia siły wiązania starterów/sond i reakcji fałszywie ujemnych), a także w sytuacji zakażenia innym genotypem lub gatunkiem patogenu. Techniki PCR są również podatne na kontaminację, dlatego powinny być wykonywane albo w systemach zamkniętych, albo w specjalnie przygotowanych pomieszczeniach/komorach minimalizujących ryzyko przeniesienia materiału genetycznego pomiędzy próbkami, w laboratoriach o odpowiedniej kontroli jakości. Ograniczenia metod opartych na PCR są ponadto związane z możliwością wykrycia patogenów o wyłącznie znanej sekwencji genetycznej. Należy pamiętać, że są one doskonałymi testami potwierdzenia, ale nie jednoznacznymi testami wykluczenia.

Zalety techniki PCR to jej szybkość (często wystarczy kilka godzin do potwierdzenia zakażenia), możliwość zaprojektowania starterów/sond do wykrywania nowo wykrytych patogenów oraz czynników odpowiedzialnych za choroby wysoce zakaźne, a także zmniejszający się koszt diagnostyki.

Materiałami diagnostycznymi mogą być krew pełna, surowica krwi, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyny surowicze, kał, mocz, tkanka i inne.

Istnieje kilka odmian PCR i połączeń tej metody z innymi technikami. Do wykrywania RNA (np. wirusy) konieczne jest zastosowanie odwrotnej transkrypcji (RT-PCR). Techniki tej nie należy mylić z coraz popularniejszą metodologią real-time PCR, czyli wykrywania produktu reakcji w czasie rzeczywistym. W technice real-time PCR mieszanina reakcyjna obok starterów zawiera także specyficzne sondy molekularne będące podstawą wykrywania materiału genetycznego danego mikroorganizmu. W trakcie reakcji dochodzi do wzrostu intensywności sygnału fluorescencyjnego, co odzwierciedla namnożenie produktu reakcji i przekłada się na reakcje dodatnie. Real-time PCR może służyć zarówno do wykrywania (test jakościowy), jak i określenia liczby kopii wybranego kwasu nukleinowego w zadanej objętości (test ilościowy), co pozwala m.in. na oznaczanie ładunku wirusowego (wiremii) w surowicy krwi lub innych materiałach biologicznych, a także na monitoring skuteczności leczenia przeciwwirusowego.

Odmianą techniki PCR jest zagnieżdżona PCR (nested PCR), którą stosuje się w celu poprawy czułości i swoistości. Wykorzystuje się w niej 2 zestawy starterów (para zewnętrzna otaczająca parę wewnętrzną), co pozwala na zmniejszenie ryzyka kontaminacji.

PCR multipleksowy zawiera wiele komplementarnych sond barwionych różnymi fluorochromami. Pozwala więc na jednoczesne wykrywanie wielu różnych patogenów. Metoda rozwijana jest dla diagnostyki molekularnej patogenów związanych z zakażeniami górnych dróg oddechowych i neuroinfekcjami oraz stosowana w szybkiej diagnostyce sepsy.

Odmianą PCR jest również technika LIPA (line probe assay) polegająca na wiązaniu amplifikowanego kwasu nukleinowego na matrycy nitrocelulozowej. Wykorzystuje się ją do określenia genotypu HBV i HCV.

Technika PCR i jej odmiany są stosowane do wykrywania szerokiego wachlarza patogenów, od bakterii, włączając trudno rosnące i wewnątrzkomórkowe, przez wirusy, również nowo pojawiające się, jak wirusy gorączek krwotocznych (Ebola czy Zika), do grzybów i pasożytów (malaria). Badania PCR znalazły również zastosowanie w wykrywaniu genów i plazmidów lekooporności bakterii. Mają też szerokie zastosowania naukowe.

Techniki molekularne do wykrywania i monitoringu liczby patogenów są cały czas rozwijane. Pojawiają się liczne modyfikacje istniejących technik łączące amplifikację z hybrydyzacją i ligacją.

7.4.3. Sekwencjonowanie i sekwencjonowanie nowej generacji

Sekwencjonowanie i sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to techniki molekularne pozwalające na identyfikację patogenów dotychczas nieznanych, określenie lekowrażliwości wirusów obecnych w surowicy krwi i w płynie mózgowo-rdzeniowym oraz analizę ich zmienności pomiędzy kompartmentami surowica krwi/płyn m.-r. (aktualnie dobrze opracowane technicznie dla HIV-1) a także na śledzenie rozprzestrzeniania się mikroorganizmów metodami filogenetycznymi.

Różnica pomiędzy techniką sekwencjonowania tak zwaną metodą Sangera (klasyczna) i technikami sekwencjonowania nowej generacji (głębokie sekwencjonowanie – deep sequencing) polega na tym, że tylko techniki NGS pozwalają na określenie ilościowe proporcji wariantów z mutacją lub substytucją (np. jaki procent populacji wirusowych w danej próbce ma mutacje lekooporności).

W diagnostyce molekularnej w chorobach zakaźnych techniki sekwencjonowania są stosowane rutynowo do oznaczania genotypowej lekooporności HIV i HCV. Mogą być również wykorzystywane do oznaczania wariantów lekoopornych w innych zakażeniach wirusowych, np. HSV-1 czy CMV. W celu stworzenia algorytmów służących do przełożenia obecności mutacji na fenotyp lekooporności używano testów fenotypowych (hamowanie replikacji wirusowej w środowisku leku) z następowym oznaczaniem zmienności genetycznej badanego wirusa. Takie analizy pozwoliły na zdefiniowanie listy mutacji związanych z lekoopornością i opracowanie algorytmów interpretacyjnych umożliwiających powiązanie wykrytych mutacji z odpornością na dany lek in vivo. Wykorzystuje się różne bazy umożliwiające interpretację danych genotypowych zawierających informacje dotyczące lekooporności, np. Los Alamos National Laboratories (http://hiv-web.lani.gov), Stanford (http://hivdb.stanford.edu), Vircolab (http://www.vircolab.com) czy geno2pheno. Bazy te są stale uaktualniane dla nowych związków między mutacjami a lekoopornością fenotypową, na podstawie których doskonalona jest interpretacja wyników genotypowania.

Opierając się na sekwencjonowaniu można także przewidywać tropizm HIV-1 (powinowactwo do koreceptora CCR5 lub CXCR4). W tym miejscu należy przypomnieć o dwóch kluczowych z punktu widzenia selekcji mutacji oporności definicjach – barierze genetycznej i jej związku z presją selekcyjnej ze strony leku oraz aktywności replikacyjnej (fitness). Bariera genetyczna dla leku jest definiowana jako selekcja mutacji lekooporności wystarczająca do przełamania działania leku. Można również powiedzieć, że bariera genetyczna to próg, od którego mutacje nabierają znaczenia klinicznego oraz szybkość (łatwość) ich selekcji pod wpływem leku lub klasy leków. Próg ten zależy od wielu czynników, w tym liczby mutacji koniecznych do utraty lekowrażliwości i ich kombinacji (niektóre mutacje mogą mieć silniejszy wpływ na zmianę stężeń hamujących niż inne). Nie ma więc prostego algorytmu określającego związek pomiędzy barierą genetyczną a liczbą mutacji. Typowo wyższa bariera genetyczna oznacza konieczność akumulacji wielu mutacji, włączając tak zwane mutacje kluczowe (major mutations) oraz mutacje dodatkowe (optymalizujące replikację wirusa w środowisku leku). Lekooporność na preparaty o niższej barierze genetycznej często rozwija się szybciej i wymaga mniejszej liczby mutacji.

Techniki sekwencjonowania są również stosowane do odkrywania nowych organizmów. Do identyfikacji rzadkich bakterii, w tym wolno rosnących lub niemożliwych do hodowli mikrobiologicznej, można zastosować skojarzoną technikę amplifikacji sekwencji kodującej jednostkę 16S rybosomalnego DNA z sekwencjonowaniem. Na podstawie zmienności tej sekwencji porównanej z dużą bazą danych sekwencji referencyjnych można dokonać identyfikacji nawet bardzo rzadkiego organizmu. Jest to metodologia czasochłonna i wciąż dość droga w rutynowej praktyce klinicznej, ale znajduje coraz szersze zastosowanie m.in. w identyfikacji prątków niegruźliczych.

7.4.4. Analizy polimorfizmu pojedynczego nukleotydu i farmakogenetyka

Identyfikacja markerów genetycznych związanych z metabolizmem leków antywirusowych i antybiotyków opiera się głównie na wykrywaniu zmian (polimorfizmów) pojedynczego nukleotydu (SNP) – naturalnej zmienności genetycznej człowieka warunkującej poziom ekspresji danego genu. Do ich oznaczania używa się zarówno technik PCR, jak i sekwencjonowania. Ich wpływ praktyczny przekłada się na częstość występowania działań niepożądanych terapii i odpowiedź na terapię, szczególnie antywirusową. Ważnym zagadnieniem jest również badanie zmienności genetycznej gospodarza i jej wpływu na podatność i progresję zakażenia (np. HIV) czy częstość samoeliminacji zakażenia (np. HCV). Warianty genetyczne związane z modyfikacją podatności gospodarza na zakażenia mogą ograniczać replikację wirusa, opóźniać lub przyspieszać wystąpienie klinicznych objawów choroby lub całkowicie ją hamować.

Aktualnie jeden wariant, HLA B*5701 związany z nadwrażliwością na abakawir, jest oznaczany w praktyce klinicznej (pierwszy szeroko stosowany test farmakogenetyczny zaadoptowany dla praktyki klinicznej). Reakcje nadwrażliwości na abakawir (ABC-HSR) były obserwowane u około 8% osób zakażonych HIV rasy kaukaskiej po zastosowaniu leku i objawiały się wysypką, gorączką, kaszlem, dusznościami, zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi lub ogólnym osłabieniem i zostały powiązane właśnie z obecnością powyższego allelu HLA-B. Oznaczanie HLA B*5701 pozwala na znaczące obniżenie częstości reakcji nadwrażliwości po włączeniu abakawiru, z dodatnią wartością prognostyczną testu na poziomie 61,2% i ujemną wartością prognostyczną 95,5%, czułością dla ABC-HSR obserwowanych klinicznie na poziomie 44% i specyficznością 96%. Częstość występowania allelu HLA B*5701 wśród osób zakażonych HIV w Polsce wynosi 4,7%.

W praktyce stosowano również oznaczanie wariantu interleukiny 28B (interferonu lambda 3) związanego z różnicami w odpowiedzi wirusowej na leczenie HCV po terapii interferonem. W związku z wprowadzeniem terapii bezinterferonowych oznaczenie to straciło na znaczeniu.

Analizy związku wariantów genetycznych z podatnością na choroby zakaźne i skutecznością ich leczenia są prowadzone w wielu pracowniach naukowych.