Читать книгу Choroby zakaźne i pasożytnicze - Группа авторов - Страница 53

7.3.1. Immunofluorescencja

Barwienie immunofluorescencyjne bezpośrednie wykorzystuje specyficzne przeciwciała powiązane z fluorescencyjnym barwnikiem dla wykrywania mikroorganizmów lub ich cząstek strukturalnych. Wizualizacji dokonuje się najczęściej po oświetleniu próbki promieniowaniem UV. Immunofluorescencja pośrednia jest oparta na technice związanej z użyciem co najmniej 2 przeciwciał, z których pierwsze, nie skoniugowane z fluorochromem, specyficznie łączy się z wykrywanym antygenem, a następnie drugie niespecyficzne poliklonalne przeciwciała emitujące i wzmacniające sygnał fluorescencyjny łączą się z przeciwciałem specyficznym.

Immunofluorescencje pośrednia i bezpośrednia znajdują zastosowanie w wykrywaniu bakterii powolnie rosnących. Immunodiagnostyka jest również stosowana w wirusologii w celu bezpośredniej identyfikacji antygenów wirusowych za pomocą przeciwciał barwionych fluorochromami (DFA). Testów DFA używa się do identyfikacji wirusów Herpes w zmianach tkankowych, a także do typowania wirusów związanych z zakażeniami górnych dróg oddechowych (grypa, paragrypa, adenowirusy, RSV, metapneumowirusy).

7.3.2. Testy aglutynacyjne

Aglutynacja wykorzystuje reakcję antygen-przeciwciało dla zlepiania cząstek antygenowych przy użyciu krwinek czerwonych (hemaglutynacja), kulek lateksowych (tzw. test lateksowy), żelatyny czy syntetycznych mikrokulek opłaszczonych przeciwciałami. Testy aglutynacyjne są względnie tanie i stosowane do szybkiej identyfikacji antygenu z różnych materiałów biologicznych (surowica krwi, płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz, kał), choć ich ograniczeniem jest niska czułość. Należy zwrócić uwagę, że w przypadku nadmiaru antygenu może dojść do reakcji fałszywie ujemnych (efekt prozone), gdy antygen wiąże wszystkie miejsca receptorowe nie pozostawiając możliwości zlepiania zależnej od przeciwciał. Reakcje fałszywie ujemne weryfikuje się poprzez odpowiednie rozcieńczenie prób. Przykłady znanych odczynów aglutynacyjnych to odczyn Widala w durze brzusznym i rzekomym (paradurze), odczyn Weila-Felixa w durze plamistym oraz odczyn Wrighta w brucelozie.

7.3.3. Diagnostyka serologiczna

Testy serologiczne pozwalają na określenie odpowiedzi przeciwciał odzwierciedlającej albo przebytą infekcję, albo efekt immunizacji. Stanowią też parametr pośredni potwierdzający aktualnie trwające zakażenie. Testy serologiczne pozwalają na określenie obecności przeciwciał w klasach IgM, IgG i czasami IgA. Niektóre metodologie badań serologicznych łączą wykrywanie antygenu i przeciwciał (np. testy IV generacji HIV, skojarzone wykrywanie przeciwciał anty-HIV-1/2 i antygenu p24).

W celu oceny zmiany miana przeciwciał konieczne jest wykonanie oznaczeń ze sparowanych surowic krwi pobranych w odstępach co najmniej 14-dniowych w przypadku chorób o przebiegu ostrym oraz w odstępach dłuższych (3–12 miesięcy) dla oceny dynamiki wygaszania przeciwciał po zakażeniu. Typowo serokonwersja z wyniku ujemnego IgM i IgG do dodatniego lub 4-krotny wzrost całkowitego miana przeciwciał stanowi odzwierciedlenie aktywnego lub niedawno przebytego zakażenia. Niekiedy ewolucja jakościowa przeciwciał skierowanych przeciwko różnym antygenom wirusowym odzwierciedla fazę zakażenia (wykrycie przeciwciał dla antygenu wczesnego i/lub kapsydowego w aktywnym zakażeniu EBV, obecność przeciwciał wiążących się z antygenem jądrowym w zakażeniach latentnych).

Testy immunoenzymatyczne

Jedną z najczęściej stosowanych technik w badaniach serologicznych jest grupa testów immunoenzymatycznych (EIA), które pozwalają na wykrycie reakcji antygen-przeciwciała poprzez jej enzymatyczne powiązanie z substratem umożliwiającym odczyt za pomocą kolorymetrii, fluorymetrii lub chemiluminescencji. Testy EIA pozwalają na wykrywanie antygenów i przeciwciał. Ich czas wykonania jest zazwyczaj krótki (2–3 godziny, a czasami mniej).

Jedną z najszerzej stosowanych modyfikacji metody EIA jest test immunoenzymosorbcyjny ELISA, w którym jedno z przeciwciał jest związane (unieruchamiane), co pozwala na wiązanie wykrywanego białka z następową reakcją barwną. Istnieje wiele modyfikacji testu ELISA, które podobnie jak testy EIA mogą być stosowane zarówno do wykrywania przeciwciał, jak i antygenów (lub obu równocześnie). Wyniki fałszywie ujemne zdarzają się w przypadku obecności znacznego nadmiaru antygenu (tzw. efekt haka), a wyniki fałszywie dodatnie wynikają z obecności przeciwciał heterofilnych, czynnika reumatoidalnego lub innych substancji interferujących.

Technik immunoenzymatycznych używa się do identyfikacji bardzo szerokiego wachlarza patogenów – bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych, atypowych, grzybów, pierwotniaków, pasożytów czy wirusów. Materiałem badanym mogą być próbki surowicy krwi, moczu, kału, płynu mózgowo-rdzeniowego, plwocina, popłuczyny oskrzelowo-płucne, wydzielina pochwowa i inne. Testy te mogą również być modyfikacją testów aglutynacyjnych. Pozwalają wtedy na wykrycie fragmentów ściany komórkowej bakterii lub lipopolisacharydów. Ich czułość jest wyższa niż testów aglutynacji, choć często nie pozwala na oznaczenie ilości antygenu obecnego w próbce. Antygenowe testy EIA są stosowane do typowania zakażeń Salmonella i Shigella oraz wykrywania toksyn A i B Clostridium difficile. Odmianami testów immunoenzymatycznych, które zwiększają czułość reakcji, są chemiluminescencja pośrednia (zmiany emisji świetlnej mogą być wykrywane już przy bardzo niewielkich natężeniach reakcji) i testy radioimmunologiczne (stosowane rzadko ze względu na konieczność spełnienia zasad bezpieczeństwa radiologicznego).

Szybkie testy diagnostyczne

Tak zwane szybkie testy diagnostyczne (POCT) są przeznaczone do wstępnej diagnostyki zakażeń bakteryjnych i wirusowych. Stanowią modyfikację testów immunologicznych (immunoenzymatycznych, immunochromatograficznych), często na podstawie prostych testów kasetowych, lub wykorzystują metody biochemiczne. Mogą być wykonane nawet w domu pacjenta i uprawdopodabniają rozpoznanie choroby.

Wskazaniem do wykonania testu są objawy kliniczne sugerujące zakażenie, choć należy podkreślić, że szybkie testy diagnostyczne mogą charakteryzować się obniżoną czułością lub swoistością oraz wydłużonym oknem diagnostycznym, więc ich interpretacja powinna być ostrożna.

Praktyczne zastosowanie mają testy pozwalające na bezpośrednie wykrycie antygenu paciorkowców z grupy A z wymazów z gardła, wirusa grypy A (lub czasami A i B) z wymazów z nosa i gardła, antygenów Streptococcus pneumoniae i Legionella pneumophila (serotyp 1) z moczu, a także antygenów rotawirusowych i adenowirusowych z kału. Należy zwrócić uwagę na wyniki fałszywie dodatnie w przypadku antygenu pneumokokowego wynikające z kolonizacji lub długotrwałego wydalania antygenu po zakażeniu inwazyjnym. Szybkie testy wykrywające antygeny Streptococcus agalactiae u ciężarnych mają niższą czułość w porównaniu z wymazami z pochwy/odbytu. Rozważa się również stosowanie szybkich testów wykrywających przeciwciała anty-HIV (okno diagnostyczne wynosi 3 miesiące, wymagane potwierdzenie metodami o wyższej specyficzności).

Odczyn wiązania dopełniacza

Odczyn wiązania dopełniacza pozwala na identyfikację obecności specyficznych przeciwciał w surowicy krwi lub płynie mózgowo-rdzeniowym poprzez wiązanie dopełniacza pochodzącego od zwierząt. Po inkubacji z określonym stężeniem dopełniacza i antygenu komplementarnego do oznaczanego przeciwciała stopień fiksacji dopełniacza pozwala na określenie miana przeciwciał, a czasem także na wykrycie określonego antygenu. Odczyn ten znalazł zastosowanie m.in. w diagnostyce zakażeń Coxiella burneti i kokcydioidomykoz.

Inne testy immunoenzymatyczne stosowane w chorobach zakaźnych

Testy oparte na metodologii western blot lub ich modyfikacje, czyli techniki immunoblottingu, techniki rekombinowanego immunoblottingu (RIBA), immunochromatografia i test liniowej precypitacji (LIA), są stosowane do wykrywania specyficznych przeciwciał z płynów biologicznych (surowicy krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego, płynów surowiczych) pobranych od pacjenta. Testy wykorzystują antygeny lub ich fragmenty związane z podłożem. Charakteryzują się dobrą czułością, choć ich główną cechą jest wysoka specyficzność. Stosuje się je do potwierdzeń zakażenia po dodatnich wynikach testów przesiewowych.

Testy oparte na technikach blottingu pozwalają na identyfikację obecności przeciwciała wiążącego konkretny antygen, dlatego ich interpretacja jest dokładniejsza niż testów EIA/ELISA. Praktycznie zastosowanie znalazły m.in. w diagnostyce zakażenia HIV, boreliozy, bąblowicy czy zakażenia HCV.

Fałszywie ujemne testy western blot lub immunoblottingu mogą zdarzyć się w przypadkach hipogammaglobulinemii lub agammaglobulinemii oraz głębokiego wyniszczenia (test zależny od produkcji przeciwciał). Ograniczeniem testów immunoblottingu jest również ich jakościowy charakter – generalnie nie służą do określenia zmienności miana przeciwciał.

Technika western blot ma poza tym liczne zastosowania badawcze w celu wykrywania białek, w tym enzymów i przeciwciał, czy potwierdzania zakażeń nowo wykrytymi czynnikami.

Testy awidności

Testy awidności opisują siłę wiązania przez przeciwciała specyficznego ligandu złożonego zawierającego co najmniej 2 miejsca wiązania. W pierwszych dniach/tygodniach zakażenia, po wytworzeniu się przeciwciał klasy IgG siła wiązania antygenu jest niska i rośnie wraz z czasem trwania zakażenia. Niska awidność odzwierciedla niską siłę wiązania przeciwciał i wczesne zakażenie. Awidność dojrzewa do wysokiej przez okres około 12 tygodni. Testy awidności wykorzystuje się w tych zakażeniach, w których przeciwciała wczesne (IgM) są często eliminowane powoli, w czasie nawet do kilku lat (np. toksoplazmoza, w której opisywano przetrwałe IgM przez 8–12 lat), lub w przypadkach wątpliwych serologicznie, szczególnie u kobiet ciężarnych. Określenie awidności przeciwciał IgG pozwala uprawdopodobnić czas zakażenia z typowym różnicowaniem czasowym powyżej lub poniżej 12 tygodni. Należy zauważyć, że w pojedynczych przypadkach awidność po przebytym zakażeniu wczesnym dojrzewa wolniej. Jej ewolucja opóźnia się także w przypadku osób, które otrzymały antybiotykoterapię hamującą namnażanie patogenu odpowiedzialnego za stymulację produkcji przeciwciał.