Читать книгу Choroby wirusowe w praktyce klinicznej - Группа авторов - Страница 45

Ważne znaczenie w diagnostyce wirusologicznej ma pobranie do badania odpowiedniego materiału diagnostycznego. W zakażeniach górnych dróg oddechowych mogą to być wymazy z nosa, gardła lub nosogardzieli, czy też aspiraty lub popłuczyny z nosogardzieli; ze względu na większą szansę wykrycia wirusa preferowane są popłuczyny z jamy nosowo-gardłowej. Wymazy należy pobierać za pomocą jałowej wymazówki nylonowej lub wiskozowej, niezalecane jest stosowanie wymazówek bawełnianych lub wykonanych z alginianu. W diagnostyce zakażeń dolnych dróg oddechowych za najlepszy materiał uznaje się pobrany w sposób aseptyczny płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego lub popłuczyny oskrzelowe. Plwocina indukowana jest najczęściej zanieczyszczona wirusami występującymi w górnych drogach oddechowych, a oprócz tego (podobnie jak aspiraty tchawicze) zawiera duże ilości śluzu, utrudniającego prawidłowe wykonanie badania.

Podstawę diagnostyki laboratoryjnej ostrych wirusowych zakażeń dróg oddechowych stanowią metody bezpośrednie, polegające na wykrywaniu zakaźnych wirionów, antygenów wirusowych lub materiału genetycznego wirusa. W przeszłości stosowano metody serologiczne, opierając się najczęściej na badaniu surowic parzystych. W ostatnich latach przydatność metod serologicznych została uznana za wątpliwą, ze względu na niewystarczającą czułość diagnostyczną (zbyt wysoki odsetek wyników fałszywie ujemnych), a także ze względu na wysokie prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywie dodatnich, co wynika w głównej mierze z wykrywania odpowiedzi serologicznej na zakażenia przebyte w niedalekiej przeszłości lub współistniejące zakażenia przebiegające bezobjawowo albo z minimalnymi objawami klinicznymi. Za złoty standard w diagnostyce wirusowych zakażeń dróg oddechowych uznaje się w dalszym ciągu izolację wirusów w hodowlach komórkowych. Technika ta ma wiele zalet, m.in. umożliwia uzyskanie wysokich mian wirusa odpowiedzialnego za zakażenie (co znacznie ułatwia jego identyfikację), jak również wykonanie bardziej specjalistycznych badań, takich jak określenie wrażliwości wyizolowanego wirusa na leki przeciwwirusowe lub dokładne określenie typu w przypadku adenowirusów lub enterowirusów. Wadą technik hodowlanych jest jednak długi czas oczekiwania na wynik (liczony niekiedy w tygodniach), a także konieczność dostępu do wysokospecjalistycznego laboratorium wirusologicznego. Dodatkową wadą technik hodowlanych jest trudność w izolacji niektórych patogenów wirusowych, jak na przykład rinowirusów, koronawirusów lub bokawirusów. Skrócenie czasu oczekiwania na wynik, przy jednoczesnym zwiększeniu czułości metod hodowlanych, uzyskano, wprowadzając kombinację SVA (shell-vial assay), czyli przyspieszonej techniki namnażania wirusów oraz immunofluorescencji bezpośredniej w celu wykrycia antygenów namnożonego wirusa.

Na rycinie 4.2 przedstawiono efekt cytopatyczny wirusa grypy A w linii komórkowej LLC-MK2.

W ostatnich latach obserwuje się dynamiczny rozwój szybkich metod diagnostycznych, polegających na wykryciu antygenów wirusowych przy użyciu testów immunochromatograficznych (tzw. testy kasetkowe). Wykorzystanie w tych testach przeciwciał monoklonalnych pozwala na uzyskanie bardzo wysokiej swoistości (nawet 97–100%), jednak metody te, z definicji, cechują się niską czułością analityczną. Oznacza to, że do uzyskania wyniku dodatniego potrzebna jest duża ilość antygenów wirusowych w badanym materiale. Dodatkowymi zaletami testów immunochromatograficznych są: możliwość ich wykonania w minimalnie wyposażonym laboratorium, krótki czas wykonania badania (10–15 min) oraz niski koszt. Obecnie dostępne są testy immunochromatograficzne służące do wykrywania wirusów grypy A i B, syncytialnego wirusa oddechowego oraz adenowirusów. Większą czułością charakteryzują się testy immunofluorescencji bezpośredniej (direct fluorescence assay, DFA) oraz testy immunoenzymatyczne (np. ELISA), jednak wymagają one odpowiedniego zaplecza laboratoryjnego oraz – szczególnie w przypadku metod immunofluorescencyjnych – personelu z odpowiednim doświadczeniem. Z praktycznego punktu widzenia czas oczekiwania na wynik badania wynosi 1–3 dni. Zwalidowane do diagnostyki in vitro metody DFA oraz immunoenzymatyczne umożliwiają wykrywanie wirusów grypy A i B, HRSV, adenowirusów, wirusów parainfluenzy 1–4 oraz enterowirusów.

RYCINA 4.2

Efekt cytopatyczny wirusa grypy A w linii komórkowej LLC-MK2 (pow. × 100).

Na rycinach 4.3 i 4.4 przedstawiono odczyn immunofluorescencji bezpośredniej z przeciwciałami swoistymi dla wirusa parainfluenzy typu 1 oraz syncytialnego wirusa oddechowego.

Zastosowanie metod biologii molekularnej, szczególnie metod amplifikacyjnych, takich jak PCR (polymerase chain reaction) lub PCR z detekcją w czasie rzeczywistym (qPCR), stanowiło przełom w możliwościach diagnostycznych, w szczególności wirusowych zakażeń dolnych dróg oddechowych. Dla techniki qPCR dostępne są obecnie testy wykrywające praktycznie wszystkie wirusy istotne z klinicznego punktu widzenia. Jednak od strony technicznej, w pojedynczej reakcji qPCR, przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego, można wykryć i zidentyfikować 2–3 gatunki wirusów, co biorąc pod uwagę liczbę gatunków wirusów oddechowych, jest dalece niewystarczające. Rozwiązaniem tego problemu jest zastosowanie zaawansowanych platform diagnostycznych, wykorzystujących zasadę qPCR i służących do równoczesnego wykrywania kilkunastu lub więcej gatunków wirusów (a także bakterii) w jednej reakcji. Paradoksalnie, wadą metod biologii molekularnej może być ich wysoka czułość. Możliwość wykrycia kilkudziesięciu kopii wirusowego RNA lub DNA oznacza, że wynik dodatni może reprezentować wirus wywołujący bezobjawowe zakażenie górnych dróg oddechowych i nie wyklucza obecności innego czynnika etiologicznego, w tym bakteryjnego.

RYCINA 4.3

Odczyn immunofluorescencji bezpośredniej z przeciwciałami swoistymi dla wirusa parainfluenzy typu 1. Zdjęcie przedstawia komórki hodowli LLC-MK2 zakażone wirusem (pow. × 400).

RYCINA 4.4

Odczyn immunofluorescencji bezpośredniej z przeciwciałami swoistymi dla syncytialnego wirusa oddechowego w preparacie odciskowym ze zmiany martwiczej w przebiegu zapalenia płuc (pow. × 400).